摘要：异种器官移植是目前解决器官短缺非常有前景的手段，基因编辑供体猪心、肾已进入人体实验。基因编辑技术是获得供体猪的核心技术，欧美国家主要依赖逐步育种或多轮体细胞核移植（SCNT），导致育种周期长、效率低，多个基因杂交培育，获得多基因编辑供体猪F1代需要10年时间。

异种器官移植是目前解决器官短缺非常有前景的手段，基因编辑供体猪心、肾已进入人体实验。基因编辑技术是获得供体猪的核心技术，欧美国家主要依赖逐步育种或多轮体细胞核移植（SCNT），导致育种周期长、效率低，多个基因杂交培育，获得多基因编辑供体猪F1代需要10年时间。这将大大限制异种器官的有效供应，是异种器官移植领域瓶颈问题。

中国医学科学院阜外医院宋江平团队与中国农业大学吴森/杜旭光团队联合攻关，创建了“一站式基因编辑”技术，提出一种全新的基于人工智能的优化共选择策略（co-selection strategy），通过引入eGFP报告基因并选择高表达细胞，显著提高了多基因编辑效率，能一次性完成不少于10种基因编辑，并表达稳定，能在半年内完成多基因编辑供体猪F1代，大大缩短供体猪培育时间，解决异种器官移植瓶颈问题。

这一研究成果于2025年3月5日Genome Research在线报道。

为了提高多基因编辑效率，研究团队开发的这种共选择策略，通过引入替代报告基因（surrogate reporter），实现对基因编辑成功细胞的筛选。

该策略的核心在于，在细胞中同时转染CRISPR-Cas9、sgRNA和报告基因，当CRISPR成功编辑目标位点时，报告基因的功能也得以恢复。由于报告基因的表达水平可以通过荧光信号检测，因此研究团队能够利用流式细胞术（FACS）精准筛选高效编辑的细胞群。研究人员以eGFP和Puro（嘌呤霉素抗性基因）作为共选择标记，在细胞筛选阶段，利用eGFP高表达或Puro抗性选择出成功编辑的细胞，并验证其基因组编辑效率。这种方法不仅能够显著提高靶向基因的编辑成功率，还能够确保细胞在纯合状态下成功编辑多个基因。

图1共选择策略

研究团队首先在猪胎儿成纤维细胞（PFFs）中验证了共选择策略的有效性。针对GGTA1、CMAH、B4GALNT2、CD46、CD47、THBD、GHR等七个关键基因，研究人员设计了多个sgRNA，并通过电转染的方式将CRISPR-Cas9、sgRNA和共选择标记（eGFP/Puro）导入细胞。

实验结果显示，共选择策略能够显著提高多基因编辑的成功率。利用流式细胞术筛选后，研究人员获得了7个基因同时纯合编辑的细胞克隆，相比于传统方法，编辑效率大幅提升。

此外，研究团队对筛选出的细胞进行Sanger测序和qPCR分析，确认目标基因的突变情况，并通过Western blot实验检测基因敲除后的蛋白表达变化，进一步验证了编辑的成功。

图2纯合基因编辑细胞筛选

在细胞实验获得成功后，研究团队进一步利用体细胞核移植（SCNT）技术，将成功编辑的PFFs用于克隆供体猪。短短5个月内，研究团队成功生成了多基因纯合编辑的供体猪，这一成果极大缩短了传统育种所需的时间。研究人员对供体猪的血液和器官组织进行了深入分析。

流式细胞术结果显示，供体猪外周血单个核细胞（PBMCs）中的α-Gal、Neu5Gc 和 SDa 抗原水平大幅降低，表明多基因编辑有效减少了异种移植的免疫屏障。

此外，免疫荧光检测显示，人源抗排斥基因hTHBD和hCD55在心脏和肾脏组织中成功表达，进一步证实了基因敲入的稳定性。通过组织病理分析，研究人员观察到基因编辑猪的主要器官结构正常，且无明显生理缺陷，说明共选择策略不仅高效，而且对供体猪的健康无明显影响。这一发现为未来基因编辑供体猪的实际应用提供了有力支持。

图3 多基因编辑猪生产

中国医学科学院阜外医院宋江平教授与中国农业大学吴森教授、杜旭光教授为共同通讯作者。该工作获得本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFC3404301，2023YFF0724700）、国家动物生物技术育种重点实验室创新项目（项目编号：2024SKLAB 1-8）以及中国高校科学基金（项目编号：2024TC167）的资助。

来源：Duan X, Chen C, Du C, et al. Homozygous editing of multiple genes for accelerated generation of xenotransplantation pigs. Genome Res. 2025 Mar 5:gr.279709.124.

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来源：中国循环杂志