Mol Cell | 西尼罗河病毒负链RNA可激活先天免疫反应

摘要：黄病毒是全球公共卫生的一大威胁，每年导致数十亿人面临感染风险。新出现的嗜神经性黄病毒，西尼罗河病毒（WNV），是美国虫媒病毒感染的主要原因，每年都会发生反复的疫情爆发，并且随着其传播媒介范围的扩大，其危害性也在不断增加。启动抗病毒先天免疫反应对于病毒清除和激活

撰文 | 一只鱼

黄病毒是全球公共卫生的一大威胁，每年导致数十亿人面临感染风险。新出现的嗜神经性黄病毒，西尼罗河病毒（WNV），是美国虫媒病毒感染的主要原因，每年都会发生反复的疫情爆发，并且随着其传播媒介范围的扩大，其危害性也在不断增加。启动抗病毒先天免疫反应对于病毒清除和激活适应性免疫反应至关重要，RIG-I类似受体（RIR）负责检测病毒RNA并激活免疫反应。但是病毒感染时，只有一小部分被感染的细胞会启动免疫反应，这背后的机制并不清楚。

2025年2月6日，来自美国华盛顿大学的Michael Gale, Jr.研究团队在MolecularCell上发表题为Exposure of negative-sense viral RNA in the cytoplasm initiates innate immunity to West Nile virus的文章，发现在WNV感染期间，负链复制中间体病毒RNA（-vRNA）在细胞质中的暴露是细胞启动先天免疫反应的基础。RIG-I介导了对这种病毒RNA的识别，而其在病毒组装过程中的暴露在细胞间具有异质性，-vRNA的累积标志着首批响应病毒感染激活先天免疫的细胞的出现。

在病毒感染过程中，只有一小部分细胞会激活抗病毒免疫反应。WNV感染细胞会诱导IRF3磷酸化并转运到细胞核中激活免疫反应，当用WNV感染细胞早期，即使所有细胞都含有很高水平的病毒RNA时，也只有部分细胞中的IRF3转运到细胞核了。接下来他们进行了基于WNV抗原和磷酸化IRF3的细胞分选，发现在免疫激活的细胞中含有更高水平的复制中间体-vRNA。为了研究-vRNA是否可以被RLR识别和结合，他们在A549-IRF3 KO细胞中进行了可逆的甲醛交联实验，随后对RIG-I进行了免疫沉淀（IRF3 KO细胞使得他们能够仅免疫沉淀参与病毒PAMP初始检测的内源性基础水平RIG-I，而不会受到干扰素诱导的RIG-I表达影响），发现RIG-I免疫沉淀产物中-vRNA明显富集，而+vRNA没有出现富集，因此RIG-I优先与-vRNA互作。

他们通RT-qPCR定量分析发现，在WNV急性复制期间，+vRNA和-vRNA的水平呈对数增长，其中+vRNA的水平在整个感染过程中比-vRNA高100至1000倍。在黄病毒复制过程中，-vRNA被认为存在于复制区室中，作为+vRNA转录的模板。接下来他们使用RNAscope技术对+vRNA和-vRNA的积累和分布随时间的变化进行了研究，发现在早期时间点（6 hpi），单链+vRNA（+ssvRNA）在感染细胞内呈点状稀疏分布，最终在核周区域聚集（12 hpi）。在后期时间点（24 hpi），部分细胞显示核vRNA，而其他细胞的vRNA则扩展到整个细胞质，并且在WNV感染期间，绝大多数+vRNA以单链形式存在。而单链-vRNA（-ssvRNA）在6 hpi和12 hpi时无法检测到，绝大多数-vRNA在整个感染过程中以双链形式存在，而-ssvRNA仅在感染后期出现。在12 hpi时，+vRNA和-vRNA仅占据感染细胞的一小部分面积，在24 hpi时，单个细胞中+vRNA占据的面积范围广泛，而-vRNA占据的细胞面积较小。接下来他们通过RNAscope和免疫荧光技术发现-ssvRNA定位于复制区室之外，并且-ssvRNA的累积与先天免疫激活相关。

由于-ssvRNA的积累发生在感染后期，它可能是病毒颗粒生产产生的。为了区分病毒RNA的复制与病毒粒子的生产，他们使用了一种缺乏病毒基因组结构蛋白编码区的WNV复制子，这种复制子能够产生vRNA但不能生成病毒颗粒。他们发现与WNV感染的细胞相比，携带复制子的细胞中-ssvRNA点状信号的数量显著减少，并且与感染WNV的细胞相比，携带复制子的细胞中NF-κB水平和白细胞介素6 （IL-6）的表达显著降低，证明-ssvRNA是激活先天免疫PRR的关键PAMP。由于病毒衣壳（C）蛋白与+vRNA相互作用并调控其包装，他们检测了C蛋白是否参与了细胞质中-ssvRNA的积累，发现与对照相比，补充C蛋白足以增加细胞内-ssvRNA的水平。因此，-ssvRNA是在组装的过程中暴露出来的，并且其缺失也会抑制先天免疫的激活。最后为了检测感染期间-ssvRNA是否在体内积累，他们对颅内感染WNV的小鼠脑切片进行了RNAscope检测和免疫荧光染色，发现皮层中部分感染细胞出现-ssvRNA的积累，并且-ssvRNA的积累具有极高的异质性，大多数感染细胞几乎没有积累-ssvRNA，而少数细胞中含有超过60个点状信号。此外，他们还从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中分化出成熟的神经元和胶质细胞，并用WNV感染，也检测到了部分细胞中出现了-ssvRNA的积累，并且这些细胞中也IRF3也表现出核定位，提示先天免疫激活。