摘要：线粒体是细胞内的能量工厂，其功能的正常运行对于细胞的生存和代谢至关重要。线粒体的生物合成依赖于大量核基因编码的蛋白质通过线粒体外膜复合体 （TOM） 和内膜复合体 （TIM） 输入线粒体基质。这一过程高度复杂且高度调控，涉及多个步骤：首先，蛋白质前体在细胞质中

撰文 | 咸姐

线粒体是细胞内的能量工厂，其功能的正常运行对于细胞的生存和代谢至关重要。线粒体的生物合成依赖于大量核基因编码的蛋白质通过线粒体外膜复合体 （TOM） 和内膜复合体 （TIM） 输入线粒体基质。这一过程高度复杂且高度调控，涉及多个步骤：首先，蛋白质前体在细胞质中合成后，通过TOM复合体进入线粒体基质，随后在TIM复合体的协助下被进一步转运至线粒体基质或嵌入线粒体内膜 （IMM） 。然而，当蛋白质输入受阻时，会导致线粒体功能障碍，甚至细胞死亡。这种输入受阻可能由多种因素引起，例如蛋白质折叠错误、输入通道堵塞或线粒体膜电位的丧失。近年来，研究者们对线粒体蛋白质输入受阻后的细胞响应机制进行了深入研究，揭示了多种质量控制途径，例如酵母中的MitoCPR （线粒体受损蛋白质输入响应） 和MitoTAD （线粒体蛋白质转运相关降解） 通路【1,2】。然而，在哺乳动物细胞中，这些机制的具体作用尚不清楚。此外，线粒体蛋白质输入受阻还可能引发细胞内的应激反应，如激活未折叠蛋白反应 （UPR） 或整合应激反应 （ISR） ，这些反应通过调节基因表达来维持细胞内环境的稳定。尽管如此，哺乳动物细胞中是否存在类似的机制，以及这些机制如何协同作用以应对线粒体蛋白质输入受阻，仍然是当前研究的热点问题。

近日，来自美国国立卫生研究院的Richard J. Youle团队和东京医科齿科大学Koji Yamano团队合作在Nature Cell Biology上在线发表了文章Mitochondrial YME1L1 governs unoccupied protein translocase channels，开发了一种哺乳动物细胞中的线粒体蛋白质输入阻断系统，模拟线粒体蛋白质输入受阻的情况，揭示了线粒体蛋白质输入受阻后细胞的响应机制，特别是YME1L1（一种ATP依赖性蛋白酶）在维持线粒体质量和细胞健康中的关键作用，其可通过降解停滞在外膜复合体中的前体蛋白，以及清除未被占据的TIM23 （线粒体内膜上的一个蛋白质转运复合体） 通道中的组分 （如TIMM17A和TIMM23） ，来维持线粒体的正常功能。

本文研究人员构建了一个用于堵塞线粒体蛋白输入通道的前体蛋白——IDF （IMMT-DHFR-FLAG） 。IDF由线粒体内膜蛋白MIC60 （包含线粒体靶向序列、跨IMM的跨膜结构域及后面的82个氨基酸） 的N端与二氢叶酸还原酶 （DHFR） 融合而成。通过在HeLa细胞中诱导表达IDF，并利用甲氨蝶呤 （MTX） 稳定DHFR结构域，研究人员成功地将IDF固定在线粒体外膜 （OMM） 的TOM复合体中，从而模拟了线粒体蛋白输入受阻的情况（图1）。实验结果表明，IDF-MTX复合体能够特异性地阻断TOM复合体，且不影响线粒体膜电位，而且其能够有效阻断线粒体对其他前体蛋白的输入，从而导致细胞生长速率显著下降。

图1 IDF结构（上）和IDF阻塞输入通道（下）示意图

mitoTAD通路可通过清除TOM复合体中堵塞的蛋白质前体来确保线粒体蛋白质输入的正常进行。已有研究表明，在酵母中，Cdc48及其辅助因子Ubx2能够结合TOM复合体，提取并降解堵塞的前体蛋白，防止细胞毒性。类似地，在哺乳动物细胞中，Cdc48的同源蛋白VCP （valosin-containing protein，即p97） 在PINK1-Parkin通路中发挥作用，清除OMM上泛素化的蛋白质。因此，本文研究人员首先评估了VCP在清除堵塞的IDF–MTX复合体中的作用。然而，研究结果显示，与酵母中的Cdc48不同，尽管VCP能够消除细胞质中的DHFR结构域，但它似乎并不能帮助降解线粒体中成熟形式的IDF或缓解哺乳动物细胞中输入通道的堵塞。同样的，已知MitoCPR是一种细胞应对线粒体蛋白质输入受阻的保护机制，通过激活特定的转录因子来增强线粒体的蛋白质降解能力，酵母中的Msp1 （一种定位于OMM的AAA ATPase） 是从TOM复合体中清除过量的线粒体前体蛋白所必需的。ATAD1 （ATPase family AAA domain containing 1） 是人类中Msp1的同源物，具有清除未输入线粒体前体或错误定位蛋白质的相似特性。然而，本文研究人员通过实验发现，在哺乳动物细胞中，ATAD1也不参与清除堵塞的IDF–MTX复合体。与此同时，研究人员还发现，虽然在使用CCCP抑制线粒体蛋白输入或通过寡霉素抑制F0/F1-ATPase引发应激的情况下，OMA1对DELE1的切割能够诱导转录因子ATF4的激活，但本研究中，IDF堵塞输入通道本身并不会通过OMA1-DELE1依赖的整合应激反应 （ISR） 激活ATF4。

至此可见，之前在酵母和哺乳动物细胞中发现的那些调节或响应蛋白质输入或OMM完整性的质量控制系统，似乎都与本研究所开发的哺乳动物细胞中的蛋白质输入阻断无关。为了解决这个问题，本文研究人员随后利用蛋白质组学分析，结合实验验证，发现IDF–MTX复合体堵塞后，TIM23复合体 （线粒体内膜上的一个重要蛋白质转运通道，负责将前体蛋白从线粒体基质转运到内膜或基质中） 的两个关键亚基——TIMM17A和TIMM23的蛋白水平显著下降，而且这个现象与诱导药物的药理作用无关，只是由IDF-MTX复合物所引起的。进一步地实验发现，TIMM17A和TIMM23的降解依赖于YME1L1 （一种线粒体内的ATP依赖性蛋白酶，属于AAA ATPase家族，在维持线粒体功能和蛋白质稳态中发挥着重要作用，尤其是在线粒体质量控制和应激响应中） 的活性，YME1L1的缺失会加剧因IDF–MTX堵塞导致的细胞生长抑制，表明在TOM复合物阻断后，YME1L1活性似乎对这种类型的线粒体应激起保护作用。值得一提的是，研究人员排除了ISR激活、mTORC1信号通路以及线粒体与核编码蛋白失衡等因素对TIMM17A降解的影响，最终确认YME1L1介导的TIM23复合体降解是线粒体蛋白输入受阻后的直接响应机制，这是首次发现与蛋白质输入和TIM23通道孔本身直接相关的降解过程，而且TIMM17A和TIMM23的降解是导致进一步蛋白质输入受阻的关键因素，而不仅仅是由于IDF堵塞TOM通道的竞争作用。此外，研究人员还确定了TIMM17A的C末端区域是YME1L1识别的关键降解信号，这个C末端的降解信号区域暴露于线粒体的膜间隙中，靠近YME1L1的活性位点。此外，YME1L1依赖的TIMM17A选择性降解并不局限于MIC60，当使用其他底物时，例如将DHFR融合到含有双信号的内膜前体蛋白时，也会发生类似的YME1L1介导的TIMM17A降解。

最后，研究人员更详细地探究了转运蛋白通道中IDF-MTX的拓扑结构。实验结果显示，IDF–MTX与TOM复合体组分有较强的相互作用，但与TIM23复合体组分的相互作用较弱。此外，通过体外合成IDF并将其与线粒体共孵育的实验，研究人员发现IDF的N端能够进入线粒体基质，但TIM23复合体并未被堵塞。进一步实验结果证实，IDF–MTX主要堵塞了TOM通道，而TIM23复合体并未被直接堵塞。然而，由于IDF的N端跨膜段进入内膜，TIM23复合体的功能受到间接影响，无法被其他前体蛋白进入。

综上所述，本研究开发了一种可以堵塞哺乳动物细胞中的TOM通道的IDF–MTX稳定复合体，深入探讨了线粒体蛋白质输入受阻后的细胞响应机制，发现在正常情况下，线粒体前体蛋白可通过TOM和TIM23输入线粒体；而当TOM通道被堵塞时，YME1L1能够识别未被占据的TIM23复合体，并降解其组分TIMM17A和TIMM23，从而防止进一步的前体蛋白输入，利于细胞生存（图2）。本研究结果揭示了YME1L1在维持线粒体质量和细胞健康中的关键作用，不仅增进了人们对线粒体蛋白质导入质量控制的理解，还为研究线粒体相关疾病提供了新的视角，为线粒体生物学和相关疾病研究提供了重要的理论基础和实验依据。

图2 YME1L1介导的TIM23通道降解模型

制版人：十一

参考文献

1. Yamano, K., Kinefuchi, H. & Kojima, W. Mitochondrial quality control via organelle and protein degradation.J. Biochem.https://doi.org/10.1093/jb/mvad106 (2024).

2. den Brave, F., Pfanner, N. & Becker, T. Mitochondrial entry gate as regulatory hub. Biochim.Biophys. Acta Mol. Cell. Res.1871, 119529 (2024).

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来源：聊科学的熊喵