AbMole| 关于材料诱导异位骨形成的实验研究

摘要：骨组织在非骨部位形成的异位骨化（HO）现象在临床上具有重要意义。来自重庆口腔疾病和生物医学科学重点实验室的Dan Li, Yucan Jiang, Ping He等多名研究人员发表了题为《Hypoxia Drives Material-Induced Hete

骨组织在非骨部位形成的异位骨化（HO）现象在临床上具有重要意义。来自重庆口腔疾病和生物医学科学重点实验室的Dan Li, Yucan Jiang, Ping He等多名研究人员发表了题为《Hypoxia Drives Material-Induced Heterotopic Bone Formation by Enhancing Osteoclastogenesis via M2/Lipid-Loaded Macrophage Axis》的研究成果。在该文章中，研究人员使用了rapamycin（AbMole，M1768）、DFO（AbMole，M5129）。研究主要探讨了缺氧在材料诱导的异位骨形成中的作用机制。

为了评估材料诱导骨形成的能力，将具有不同物理化学性质的两种钙磷陶瓷（TCPB 和 MG）植入 FVB 小鼠的臀肌中。6 周后，组织学分析显示，MG 植入物内检测到新骨形成，在脱钙切片和非脱钙切片中均能观察到骨组织，而 TCPB 中未观察到骨形成。这一结果证实了材料诱导异位骨形成的材料依赖性，同时也验证了 FVB 小鼠臀肌内植入模型可用于研究材料诱导的异位骨形成。

图1 TCPB 和 MG 植入物中缺氧、HIF-1α表达和 CaP 诱导的骨形成。

通过对 MG 和 TCPB 植入物中缺氧和 HIF - 1α 表达的研究发现，从植入后第 1 周到第 2 周，两种植入物中的细胞都变得更加缺氧，且 MG 植入物比 TCPB 植入物更缺氧。具体表现为，MG 植入物中 pimonidazole 水平更高，缺氧相关基因（如 Aldoc、Xbp1、Ramp3、Slc2a1、Pfk1、Mcl1、Lrg1、Hif - 1α 等）显著上调，Hif - 1α 基因在第 1 周和第 2 周的表达显著高于 TCPB 植入物。

图2 HIF-1α抑制剂（雷帕霉素和 PX-478）对第 1 周 MG 和 TCPB 植入物中 HIF-1α表达和巨噬细胞极化的影响。

为了探究血管生成在材料诱导骨形成中的作用，对 MG 和 TCPB 植入物进行了相关检测。结果表明，无论是通过肉眼观察 CD31、α - Smooth Muscle Actin（α - SMA）和 Endomucin（EMCN）的免疫染色，还是进行转录组分析检测血管生成相关基因（如 Vegfb、Angpt4、Egf、Vegfc、Vegfd、Angpt1、Pecam1、Emcn、Eng）的表达，以及通过 RT - qPCR 检测 Cd31、Emcn 和 Vegfa 基因的表达，都未发现 MG 和 TCPB 植入物在第 1 周和第 2 周时血管形成存在差异。

体内实验：使用 HIF - 1α 抑制剂（rapamycin 和 PX - 478）处理后，MG 植入物中 HIF - 1α 阳性细胞、Arginase 1（ARG - 1）阳性细胞、F4/80 阳性细胞和 CCR7 阳性细胞减少，Hif - 1α 和 Arg - 1 基因表达显著下调。同时，Cathepsin K（CTSK）阳性细胞和 TRAP 阳性细胞减少，Trap 和 Ctsk 基因表达降低。这表明 HIF - 1α 抑制剂抑制了巨噬细胞向 M2 极化和破骨细胞生成。

图3 时间依赖性 HIF-1α HIF-1 α抑制剂的激活和 HIF-1抑制剂对腹膜内注射后骨形成的影响。

体外实验：在体外培养的骨髓来源巨噬细胞（mBMDMs）中，引入 rapamycin 后，Arg - 1 基因表达显著下调，CD206 阳性细胞减少，但 Cd163 基因表达无显著变化。低氧则显著上调 Arg - 1 基因表达，但对 CD206 阳性细胞和 Cd163 基因表达影响不大。此外，rapamycin 处理显著下调了 Trap 和 Ctsk 基因表达，减少了 TRAP 阳性细胞和 CD61 阳性细胞；低氧则显著上调了 Trap 和 Ctsk 基因表达，增加了 TRAP 阳性细胞和 CD61 阳性细胞。这些结果表明，HIF - 1α 抑制剂在体外抑制了巨噬细胞向 M2 极化和破骨细胞生成，而低氧则促进了这些过程。

通过对植入小鼠使用 HIF - 1α 抑制剂（rapamycin 和 PX - 478）和 HIF - 1α 激活剂（desferrioxamine，DFO）来研究 HIF - 1α 对材料诱导骨形成的影响。结果发现，在术后前 2 周腹腔注射 Rapamycin 和 PX - 478 显著抑制了 MG 植入物中的骨形成，而在术后 2 周内注射 DFO 增强了 MG 植入物中的异位骨形成，甚至使非 osteoinductive 的 TCPB 也能形成异位骨。在第 3 周和第 4 周注射 Rapamycin 则不抑制骨形成。

对 mBMDMs 进行转录组和靶向代谢组分析发现，当用 rapamycin 处理 mBMDMs 时，破骨细胞生成相关基因（如 Trap、Ctsk、Mmp9、Itgb3、Nfact1、Dc - stamp、Ckb、Calcr、Atp6v0d2、Oc - stamp、Oscar 等）和脂质积累相关基因（如 Srebf1、Lss、Hmgcs1、Slc25a1、Fads2、Scd1、Scd2 等）显著下调，总脂质产生减少，其中磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）受影响最为明显。低氧则增强了脂质积累，增加了破骨细胞生成。当在体外破骨细胞生成评价体系中引入脂质积累抑制剂 GW3965 时，破骨细胞和脂质滴减少；引入脂质积累激活剂 GSK2033 时，破骨细胞和脂质滴增加。此外，用 cinnamycin 灭活 PE 或用抗 CD36 抗体阻断 CD36 时，破骨细胞形成受到抑制。

通过培养 MSCs 与有无破骨细胞生成条件培养基以及含有 rapamycin 的条件培养基，来评估破骨细胞生成对 MSCs 成骨分化的影响。结果表明，与不含破骨细胞生成条件培养基的对照组相比，含有破骨细胞生成条件培养基的 MSCs 培养物中 Alkaline phosphatase（ALP）产生和 Alp 基因表达增加，而当破骨细胞生成培养基中存在 rapamycin 时，Alp 基因表达和 ALP 产生受到抑制。同时，rapamycin 处理还显著下调了破骨细胞生成过程中 Cthrc1 和 Sphk1 基因的表达，降低了 CTHRC1 和 S1P 蛋白的分泌水平。