摘要：近日，Nature期刊上发表了一篇名为“STAT5 and STAT3 balance shapes dendritic cell function and tumour immunity”的文章，该文章由密歇根大学医学院邹伟平团队撰写，该团队研究了STAT5
近日，Nature期刊上发表了一篇名为“STAT5 and STAT3 balance shapes dendritic cell function and tumour immunity”的文章，该文章由密歇根大学医学院邹伟平团队撰写，该团队研究了STAT5和STAT3信号通路在树突状细胞（DCs）中的平衡如何影响肿瘤免疫反应，以及免疫检查点阻断（ICB）疗法的疗效。研究发现，ICB能够重新编程DCs中STAT3和STAT5的相互作用，激活T细胞免疫，从而增强ICB的疗效。此外，研究还开发了两种PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）降解剂SD-36和SD-2301，它们能够有效降解STAT3蛋白，重新编程DCs的转录网络，增强免疫原性，并在小鼠模型中显示出对晚期和ICB耐药肿瘤的治疗效果。
基础知识点小栈
免疫检查点阻断（ICB）：一种癌症免疫疗法，通过阻断免疫检查点蛋白（如PD-1、CTLA-4）来增强T细胞对肿瘤细胞的攻击。树突状细胞（DCs）：免疫系统中的关键细胞，负责向T细胞呈递肿瘤抗原，激活和启动T细胞介导的免疫反应。STAT信号通路：在免疫细胞中起关键作用的信号通路，其中STAT3通常在肿瘤微环境中被激活，导致免疫抑制，而STAT5则对免疫反应有积极作用。基础实验小课堂
该文章展示的结果图里面，除大量的统计结果数据外，其余基本上是一些免疫印记的实验结果图，免疫印记实验属于基础的实验手段，常用于经敲低或过表达处理细胞后观察目的蛋白的表达量的变化。下面，让我们一起来学习下该技术的具体细节吧。以下面的结果图为例。
a,b，显示shStat3 JAWSII细胞（a）以及Stat3+/+和Stat3−/−cDC1s（b）中转录因子的免疫印迹。n=3。c，散点图显示与相应−log10（P值）相对的相对像素密度，用于与LPS刺激的Stat3+/+和Stat3−/−cDC1s的裂解物一起孵育的磷酸化抗体阵列。
免疫沉淀和免疫印迹分析实验流程
a. shStat3 JAWSII细胞中敲除STAT3后转录因子的免疫印记图：
1. 将细胞用免疫沉淀裂解缓冲液裂解；[免疫沉淀裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；120 mM NaCl；1 mM EDTA；0.5%NP-40）,并且补充了Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物]
2. 将细胞进行超声处理；
3. 1,000 μg总细胞裂解液与适当的抗体（2 μg）一起孵育，4°C下旋转过夜；
4. 将步骤3与Protein A/G Sepharose珠子孵育3小时；
5. 将免疫复合物用洗涤缓冲液洗涤三次，[洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；100 mM NaCl；1 mM EDTA；0.2%NP-40）]
6. 通过加入样品缓冲液并煮沸10分钟来变性免疫沉淀的蛋白，之后通过SDS-PAGE分离，并用指定抗体进行免疫印迹分析。
b. Stat3+/+和Stat3−/−cDC1s中转录因子的免疫印迹图：
1. 将细胞用RIPA缓冲液中裂解；[RIPA缓冲液中补充了Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物]。
2. 通过BCA蛋白定量试剂盒测定细胞裂解液的蛋白浓度。
3. 等量的总细胞蛋白通过SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用指定抗体进行免疫印迹分析。
c: 与LPS刺激的Stat3+/+和Stat3−/−cDC1s的裂解物一起孵育的磷酸化抗体阵列分析图:
1. cDC1s用LPS（20 ng/ml）处理3小时后裂解提取蛋白。
2. 裂解液使用Proteome Profiler Phospho-Kinase Array Kit进行分析，按照使用说明操作。
3. Western blotting数据通过Image Lab 6.1和ImageJ 1.51n进行处理和分析。
实验中用到的试剂信息：
在b1步骤中，使用到的试剂是Thermo Fisher Scientific的试剂，产品货号为89901。
产品信息图，来源：Thermo Fisher Scientific网站
产品链接：
https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/89901?SID=srch-srp-89901
研究方法与结果
首先，作者通过单细胞和批量RNA测序，分析了接受ICB治疗的癌症患者的肿瘤组织中的DCs，研究STAT5和STAT3的转录路径与T细胞免疫的关系。
研究发现，接受ICB治疗的患者中，DC1成熟度高且STAT5/STAT3表达比值高的患者生存期更长（蓝线），表明DC1成熟度和STAT5/STAT3平衡可能影响ICB的疗效。
接下来，团队通过基因敲除和药理方法，抑制了STAT3信号通路，观察对DC1激活和T细胞免疫反应的影响。
基因敲除：
药理研究：
结果发现，STAT3对DC功能起到了抑制的作用，通过基因敲除和药理抑制STAT3，发现STAT3的缺失或抑制能够增强DC1的成熟和功能，提高T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。
针对以上现象，开发并测试了两种针对STAT3的PROTAC降解剂：SD-36和SD-2301，以评估它们在体外和体内模型中对DCs功能和肿瘤生长的影响。
SD-36和SD-2301的分子示意图
对肿瘤的作用：
促进免疫的作用：
PROTAC降解剂的效果：SD-36和SD-2301能够有效降解DCs中的STAT3蛋白，增强DC1的成熟和功能，提高T细胞的激活和细胞毒性，从而在多种肿瘤模型中显示出治疗效果，包括对ICB耐药的肿瘤。
关键结论
STAT3和STAT5的平衡：在DCs中，STAT3和STAT5的平衡对肿瘤免疫反应和ICB疗效至关重要。STAT3的过度激活会抑制DC1的成熟和功能，而STAT5的激活则有助于增强免疫反应。STAT3降解剂的潜力：通过降解STAT3，可以重新编程DCs的转录网络，增强其免疫原性，从而提高抗肿瘤免疫反应。SD-36和SD-2301作为STAT3降解剂，在治疗晚期和ICB耐药肿瘤方面显示出潜力，为癌症免疫治疗提供了新的策略。这项研究不仅揭示了DCs中STAT信号通路在肿瘤免疫中的作用机制，还为开发新的癌症免疫治疗策略提供了理论基础和实验依据。通过调节STAT3和STAT5的平衡，可以增强DCs的功能，提高ICB疗法的疗效，为治疗晚期和耐药性肿瘤提供了新的希望。
来源：富翔科学论