摘要：体液中痕量生物标志物的现场检测（POCT）对于健康监测和早期诊断至关重要。然而，由于只有一小部分生物分子可以从血管运输到唾液中，唾液中这些生物标志物的超低浓度（fM到pM水平）极大地阻碍了它们的准确检测。为了促进非侵入性唾液诊断，迫切需要开发低成本高灵敏生物传
体液中痕量生物标志物的现场检测（POCT）对于健康监测和早期诊断至关重要。然而，由于只有一小部分生物分子可以从血管运输到唾液中，唾液中这些生物标志物的超低浓度（fM到pM水平）极大地阻碍了它们的准确检测。为了促进非侵入性唾液诊断，迫切需要开发低成本高灵敏生物传感器，而超越常规临床测试的超高灵敏度仍然是一个巨大的挑战。
近日，中山大学材料科学与工程学院谢庄副教授及附属第一医院张丽梅博士（共同通讯作者）在Biosensors and Bioelectronics上发表了题为“Engineering 3D Microtip Gates of All-Polymer Organic Electrochemical Transistors for Rapid Femtomolar Nucleic-Acid-Based Saliva Testing”的论文。这项工作开发了一种微针尖型全聚合物有机电化学晶体管（Microtip All-polymer Organic ElectroChemical Transistor，MAOECT）生物传感器（图1），使用高导电高柔性LiTFSI掺杂的PEDOT:PSS同时作为通道和栅极，并利用核酸功能化的AuNPs修饰3D微针尖栅极界面，能够在几分钟内直接检测高度稀释的唾液中fM级女性激素（例如孕酮）和寡核苷酸口腔癌生物标志物。
图1 基于核酸的MAOECT的3D微尖栅极用于快速、灵敏唾液测试
该栅极由金字塔形微尖阵列组成，覆有LiTFSI掺杂的PEDOT：PSS聚合物以赋予电极高导电性、水稳定性和柔软性。为了促进DNA固定，AuNPs被电化学沉积在PEDOT：PSS/LiTFSI栅极上（图2a）。接下来，用核酸（如P4适配体）以及6-巯基己醇和牛血清白蛋白的封闭剂对栅极依次进行修饰。获得的微尖生物传感界面被BSA致密覆盖（图2b），表明有效的电极阻断以防止生物体液中的非特异性吸收。微尖栅极与AuNPs耦合的使用增加了电容并促进了质量传输，与平面栅极相比，检测限降低了10-100倍（图2d-g）。这些结果展示了微尖栅极OECT在高灵敏检测小分子激素和生物大分子方面的潜力。
图23D微针尖栅极的传感界面表征及其与平面栅极的检测能力对比
为了实现居家POCT，在柔性塑料基板上进一步开发了完全印刷的一次性MAOECT生物传感器。该MAOECT在高达20000个弯曲循环中表现出显着的机械稳健性（图3a）。研究表明，当栅极界面的电容等于通道/电解质界面的电容时，可能会实现最大灵敏度。因此，通过调节栅极面积，在维持通道电容不变的情况下，此MAOECT实现了可调的传感性能，对P4的检测限低于fM级别且具有较宽的检测范围（图3b-d）。此外，通过在栅极上施加外电场，该MAOECT对核酸分子的响应时间缩短至5 min，实现了快速的生物分子传感响应（图3e-f）。
图3 MAOECT的弯曲性能、可调传感性能及在电场下的快速响应能力
唾液含有pM水平的游离P4，在不同时期有规律地波动。此外，唾液中ORAOV1寡核苷酸的表达与肿瘤大小相关，可作为口腔癌的生物标志物。鉴于唾液中类固醇激素和癌症的丰度较低，快速和简单的POCT仍然是一个挑战。为了验证MAOECT生物传感器在复杂唾液中的检测效果，对常见干扰物种进行了特异性评估（图4a-b）。对于唾液中常见的干扰物及相似的DNA序列，该MAOECT具有较好的目标物识别准确性和对非目标DNA干扰的强大判别能力。随后在高度稀释的唾液样本中进行加标检测，证明了该MAOECT在唾液中进行高灵敏的P4和ORAOV1 DNA的检测能力（fM级别）。这些特征以及MAOECT的易于集成性，充分证明了通过唾液检测进行非侵入性女性健康监测和临床口腔癌诊断的前景。
图4 MAOECT的特异性以及唾液中的高灵敏目标物检测
最后，为了展示女性健康监测潜力，该MAOECT被用来监测女性唾液样本中P4水平的波动（图5）。一个生理周期内收集的唾液样本稀释1000倍，随后通过转移曲线进行表征并利用线性拟合的校准曲线来估计唾液样本中的P4水平。可以发现，唾液中的P4浓度在最初两周内保持相对稳定，为0.1 nM。当排卵发生在第14天左右时，P4水平上升（即第18天的0.26 nM），表明卵巢黄体期和生殖内膜向分泌期的转变。在第21天，P4水平达到0.6 nM的峰值，升高超过5倍，提示子宫为胚胎植入做好准备。在月经周期的最后一周，P4水平在第28天降至数十pM。该MAOECT检测的P4水平的波动与现有文献一致，表明在医疗保健中的实际应用具有巨大潜力，特别是生育窗口追踪和妊娠管理。
图5MAOECT检测28天月经周期女性唾液样本中P4水平
总结：这项工作展示了一种超灵敏的全PEDOT：PSS电化学晶体管生物传感平台，通过核酸修饰微针尖栅极实现了fM级检测能力和几分钟内的快速响应。因此，通过这种全聚合物OECT可以对高度稀释的多种唾液生物标志物进行直接检测，而无需复杂的处理过程，有助于居家监测女性健康和早期口腔癌诊断。期待此类柔性全聚合物生物传感平台将进一步拓展至连续、实时和多路复用的生物标志物监测，推动可穿戴和可植入医疗器件和个性化医学的发展。
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来源：高分子科学前沿
