摘要：无论您仍处于研究阶段还是向临床或商业化迈进，4D-Nucleofector® LV单元都能帮助您应对这些挑战。该系统支持封闭式、可扩展的转染，最高可达10亿细胞，并提供用于研究用途和GMP生产的耗材，以及符合21 CFR part 11要求的软件。
大体积转染是贯穿整个细胞和基因治疗流程的重要工具，无论是早期研究、临床前阶段还是先进治疗药物（ATMP）的生产。
随着细胞和基因治疗向临床转化推进，规模化能力无疑成为一项必备要求。此外，记录工艺中所用原材料是否符合GMP规范以确保患者安全也变得越来越重要。
无论您仍处于研究阶段还是向临床或商业化迈进，4D-Nucleofector® LV单元都能帮助您应对这些挑战。该系统支持封闭式、可扩展的转染，最高可达10亿细胞，并提供用于研究用途和GMP生产的耗材，以及符合21 CFR part 11要求的软件。
4D-Nucleofector® LV单元在其非病毒、离体细胞和基因治疗流程中高效修饰大体积细胞。该技术的应用范围涵盖从研究到临床阶段，包括mRNA、CRISPR敲除、碱基或先导编辑等多种方法。
4D-Nucleofector® LV单元与碱基编辑
Chiesa等人（2023）
《碱基编辑的CAR7 T细胞治疗复发性T细胞急性淋巴细胞白血病》
《新英格兰医学杂志》389(10):899-910
阶段：I期临床试验
疾病：急性淋巴细胞白血病（ALL）
治疗：CAR-T细胞（异体）
基因修饰方法：
作者结合碱基编辑（胞苷脱氨）灭活CD52、CD7和TCR β链以防止移植物抗宿主病，随后通过慢病毒整合CD7特异性CAR。碱基编辑步骤中，健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）经2天激活后，使用4D-Nucleofector® LV单元转染coBE mRNA（编码碱基编辑器蛋白：一种催化受损的Cas9切口酶与大鼠来源的单链DNA脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶融合）及靶向TRBC1和TRBC2的sgRNA。次日，细胞进行CAR插入的转导，培养10天后冷冻保存。CD52、CD7和TCR的敲除效率为92%至99%。
在I期试验中，3名复发性ALL儿童接受了这种异体CAR-T细胞治疗的安全性评估。研究验证了碱基编辑作为治疗方法的可行性，但也指出了免疫治疗中可能出现的并发症。
Woodruff等人（2023）
《大规模生产碱基编辑的嵌合抗原受体T细胞》
《分子治疗方法与临床发展》31:101123
阶段：临床前
疾病：N/A
治疗：CAR-T细胞（异体）
基因修饰方法：
研究人员通过碱基编辑敲除健康供体T细胞中的PD-1，随后用慢病毒转导抗CD19 CAR。在碱基编辑中，他们比较了线性mRNA与环状mRNA的效果。小规模验证后，将应用扩展至大规模生产临床剂量的1×108 CAR-T细胞。简言之，经2天激活的PBMCs或CD4+/CD8⁷ T细胞以5×10⁷ mL的浓度转染不同量的BE4max环状RNA和靶向PD-1的sgRNA。转染后一天，细胞进行抗CD19 CAR转导，再培养9天。根据环状mRNA用量，碱基转换效率为86%至接近完全转换。
作者证明，在临床规模下使用环状mRNA能以8倍更少的RNA实现更高的编辑效率，从而显著降低成本。
Georgiadis等人（2021）
《碱基编辑的CAR T细胞用于T细胞恶性肿瘤的联合治疗》
《白血病》35(12):3466-3481
阶段：临床前
疾病：T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）
治疗：CAR-T细胞（异体）
基因修饰方法：
伦敦大学学院的研究团队通过碱基编辑（或CRISPR NHEJ）敲除TCR/CD3和CD7，随后慢病毒引入CAR。敲除CD3和CD7旨在避免治疗T细胞恶性肿瘤时的“自相残杀”。简言之，从健康供体分离PBMCs并激活，随后用靶向TCR恒定β链（TRBC）和CD7的sgRNA及SpCas9 mRNA或coBE3 dCas9 mRNA通过4D-Nucleofector® LV单元转染。24小时后，细胞用慢病毒载体转导，表达靶向CD3（3CAR）和CD7（7CAR）的CAR。结果显示，CAR表达稳健，TCRαβ/CD3和CD7的表面表达单敲除效率为50%至>95%，双敲除为37%至60%。3CAR和7CAR共培养可实现“自我富集”，获得99.6% TCR–/CD3–/CD7–细胞群体。这些细胞表现出特异性细胞毒性，无脱靶活性或碱基转换问题。3CAR和7CAR T细胞还在人源化小鼠异种移植模型中评估了抗白血病效力。
4D-Nucleofector® LV单元与CRISPR敲除
Ottoviano等人（2022）
《CRISPR工程化CAR19通用T细胞治疗难治性B细胞白血病儿童的I期临床试验》
《科学转化医学》14, eabq3010
阶段：I期临床试验
疾病：B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）
治疗：CAR-T细胞（异体）
基因修饰方法：
作者结合慢病毒引入靶向CD19的CAR和CRISPR gRNA（靶向TRAC和CD52），并通过非病毒方式传递Cas9 mRNA。简言之，健康供体的PBMCs激活1天后，用慢病毒载体转导编码抗CD19 CAR基因及靶向TRAC和CD52的sgRNA以实现多重编辑。3天后，细胞通过4D-Nucleofector® LV单元转染Cas9 mRNA。转染后，细胞进一步扩增，7天后通过磁珠去除残留的TCRαβ表达T细胞。该方法实现了86%至98%的CAR19表达，残留TCR表达为0.1%至1%。
在I期临床试验中，6名难治/复发性CD19阳性B-ALL儿童接受了治疗。研究证明了CRISPR免疫疗法的可行性、安全性和治疗潜力，其中2名儿童病情缓解。
Vazquez-Lombardi等人（2022）
《通过功能筛选的高通量T细胞受体工程鉴定出效力和特异性增强的候选分子》
《免疫》55:1953–1966
阶段：研究
疾病：N/A
治疗：TCR
基因修饰方法：
本研究旨在开发一种识别高效力和高特异性工程化T细胞受体（TCR）的方法。建立的“TCR引擎”高通量方法结合了CRISPR基因组编辑、计算TCR设计和深度测序。简言之，通过CRISPR-Cas使用小规模4D-Nucleofector® X单元修饰Jurkat细胞，生成TCR受体细胞系（TnT）。通过五步连续整合Cas9、人CD8、NFAT-GFP和mRuby（通过HDR），并删除内源性CD4、TCRα和Fas（通过NHEJ）。每一步后，通过流式分选细胞并测序验证。随后设计靶向MAGE-A3（TCR-A3）的>30种突变TCR变体的组合HDR模板库，与靶向内源性TCRβ的gRNA一起通过4D-Nucleofector® LV单元转染1亿TnT细胞。通过综合筛选程序鉴定出目标识别增强的TCR变体，并在原代T细胞中进一步验证其安全性和效力。
Lattanzi等人（2021）
《人类造血干细胞中β-珠蛋白基因校正的开发作为镰状细胞病的潜在持久治疗》
《科学转化医学》13(598):eabf2444
阶段：临床前（支持IND的研究）
疾病：镰状细胞病（SCD）
治疗：基因校正
基因修饰方法：
研究人员结合非病毒电穿孔递送CRISPR RNP和重组腺相关病毒递送HDR模板，校正导致SCD的β-珠蛋白（HBB）基因点突变。临床规模下，60%的HBB等位基因得到校正。移植至NSG小鼠后观察到20%的基因校正，且未发现基因毒性或致瘤性。
4D-Nucleofector® LV与病毒生产
Nawandar等人（2022）
《通过合成基因组重组表达生产的人细小病毒》（bioRxiv预印本）
阶段：研究
疾病：N/A
基因修饰方法：
细小病毒（Anelloviruses）在人类中普遍存在，但免疫原性较低且不致病。因此，基于这些病毒开发基因疗法可能成为其他常用病毒的有力替代方案，并允许重复给药。目前，由于缺乏体外生产该病毒的系统，其生物学特性尚未得到广泛研究。
本研究通过转染T细胞来源的MOLT-4细胞系，成功实现了两种β扭转病毒（Betatorquevirus，细小病毒属之一）的重组生产。实验中使用的质粒编码该病毒属的LY2基因组或nrVL4619基因组。简而言之，小规模试验（转染1000万细胞）后，进一步扩大生产规模：使用4D-Nucleofector® LV Unit系统，在20 mL连续流工艺中转染20亿细胞（质粒用量2 mg）。分析内容包括病毒基因表达、复制、电子显微镜成像以及组织特异性体内感染实验。该工作为这一潜力病毒家族的后续研究奠定了基础。
来源：博儿爱科学
