摘要：液体活检溶液的粘度可以显著影响生物传感器的检测效率。在较高粘度的溶液中，分子的扩散速率可能降低，从而可能损害依赖于扩散过程的生物传感器的检测效率。这在目标分子与生物传感器表面迅速接触对于检测至关重要的情况下尤其关键。此外，高粘度可能会破坏液体活检溶液与生物传感

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液体活检溶液的粘度可以显著影响生物传感器的检测效率。在较高粘度的溶液中，分子的扩散速率可能降低，从而可能损害依赖于扩散过程的生物传感器的检测效率。这在目标分子与生物传感器表面迅速接触对于检测至关重要的情况下尤其关键。此外，高粘度可能会破坏液体活检溶液与生物传感器表面之间的均匀接触，进而降低生物传感器捕获目标分子的效率。（1）因此，粘稠样本必须在检测前用磷酸盐缓冲液（PBS）或裂解缓冲液稀释，这可能会影响生物标志物浓度测量的效率。可测试的临床液体活检包括血液、血清、血浆、尿液、眼泪、间质液（ISF）、唾液和痰液。在这些液体中，皮肤ISF是可溶性生物标志物的特别丰富来源，如蛋白质、肽、代谢物和核酸，这些物质与血液密切相关。检测与生理状况相关的生物标志物对于医疗保健和疾病管理提供了重要的见解。然而，采样和分析的挑战增加了在皮肤表皮层和黏稠液体活检样本中检测和定量蛋白质生物标志物的复杂性。

来自高雄医学大学的Hung-Wei Yang等团队提出了‘Lab-on-the-Needles’（针头实验室）概念，利用基于微针贴片的传感盒（MNP-based SenBox）用于移动医疗应用。该系统能够快速捕获来自皮肤表皮层的原位或液体活检中的蛋白质生物标志物，随后进行即时评估。通过整合辣根过氧化物酶结合的沸石咪唑框架-8（HRP@ZIF-8）作为灵敏且稳定的信号探针，抗SARS-CoV-2 NP IgA抗体及各种SARS-CoV-2 S1P突变株的检测限比FDA批准的商用唾液侧流免疫快速测试至少提高了1000倍。此外，MNP-based SenBox使用便携式ColorReader在30分钟内对大鼠体内的炎症细胞因子水平（TNF-α和IL-1β）进行了最小侵入性的监测和快速定量。本研究突显了MNP-based SenBox在最小侵入性收集和分析来自皮肤表皮层原位或液体活检中的蛋白质生物标志物方面的潜力，这可能会促进移动医疗诊断和纵向监测。相关工作以题为“Lab-on-the-Needles: A Microneedle Patch-Based Mobile Unit for Highly Sensitive Ex Vivo and In Vivo Detection of Protein Biomarkers”的文章发表在2025年01月06日的期刊《ACS Nano》。

【基于MNP的SenBox设计与制作】

本文引入的生物传感技术依赖于用生物识别元件（如抗体或抗原）功能化的MNP，这些元件以浓度依赖性方式选择性捕获表皮组织或液体活检样本中的蛋白质生物标志物（如抗原或抗体），并结合新设计的操作盒。随后，通过使用便携式ColorReader（图1）进行的超灵敏比色免疫测定对MNP表面捕获的蛋白质生物标志物进行定量。为了有效捕获表皮组织和粘稠液体活检中的蛋白质生物标志物，MNP需要表现出高生物识别元件偶联效率和蛋白质-抗体结合能力。因此，本文以自组装的方式在MNP表面涂覆金纳米粒子（AuNPs），使表面粗糙化，增加表面积，并简化生物识别元件偶联过程。

为实现这一目标，首先通过在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）硅烷化的聚（L-乳酸）（PLLA）MNP上迭代层-层（LBL）吸附聚（4-苯乙烯磺酸钠）（PSS）和聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH）来创建具有丰富氨基表面的MNP，形成LBLPSS/PAH-PLLA MNP（图2A）。在傅里叶变换红外（FTIR）光谱中，本文观察到3230 cm–1处的N-H伸缩振动峰，同时在1082和1267 cm–1处观察到Si-O-Si和Si-O-C键的吸收峰，表明APTES硅烷化的PLLA MNP中存在这些键。这些发现提供了证据，证明PLLA MNP确实与APTES共价官能化。随后，使用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）测定法确认LBLPSS/PAH-PLLA MNP表面成功涂覆了氨基基团。如图2B所示，与裸PLLA MNP和LBLPAH/PSS/PAH-PLLA MNP相比，LBLPSS/PAH-PLLA MNP组呈现出更深的黄色和更高的345 nm吸光度强度，这表明APTES预处理促进了MNP表面上PEM的形成，导致强烈的正电荷，有利于带负电的AuNPs（-22.5 ± 2.8 mV）的后续自组装。AuNPs尺寸均匀，为20.9 ± 1.5 nm。本文研究了促进AbRBD在AuNPs@MNP上偶联的AuNPs涂层最佳持续时间。结果表明，仅需0.5小时即可达到峰值结合效率。这表明，AuNPs在LBLPSS/PAH-PLLA MNP上仅需0.5小时的自组装时间就足以使生物识别元件修饰在AuNPs@MNP上达到饱和，这将大大缩短基于MNP的生物传感器的制备时间。随后，采用局部表面等离子体共振（LSPR）分析验证了AbRBD通过Au-S键合偶联到AuNPs@MNP上。LSPR对折射率变化高度敏感，分子偶联到金属纳米粒子表面会引起LSPR位置的变化。在AbRBD偶联后，LSPR光谱中观察到明显的等离子体红移，表明AbRBD偶联后出现6 nm的光谱红移，BSA封闭后进一步出现9 nm的光谱红移，证实了AbRBD@MNP的成功制备。

图1 基于MNP的SenBox示意图，用于快速、移动式医疗中表皮和液体活检（尤其是高粘度样本）中的蛋白质生物标志物检测

图2 基于MNP的快速检测的开发过程和检测机理

【高度敏感的HRP@ZIF-8的合成与表征】

在解决当前MHCT检测信号源局限性的过程中，必须降低传统ELISA程序固有的操作复杂性，同时提高检测灵敏度和信号源稳定性。ZIF-8作为一种关键材料，因其能够封装多种酶并稳定其结构而脱颖而出。此外，ZIF-8还能够与巯基化生物分子快速形成共价键，因此作为信号探针的支架。因此，本研究采用一步法在室温下制备了HRP@ZIF-8，作为高灵敏度检测信号探针的支架（图3A）。从透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）图像中可以看出（图3B），ZIF-8和HRP@ZIF-8均呈现出典型的菱形十二面体形态。合成的ZIF-8作为对照，直径为1.5微米，具有多孔结构。与此同时，HRP@ZIF-8则呈现为较小的颗粒（直径800纳米，尺寸减小46%），部分呈实心形态，这可能是由于多个成核种子的存在（异相成核过程），导致更多较小的晶体和更致密的结构。颗粒大小的异质性归因于单个ZIF-8颗粒内HRP负载程度的不同。尽管存在这种大小变化，但由于封装过程创造了一个有利于稳定和增强酶活性的微环境，因此不会对催化性能产生不利影响。通过X射线衍射（XRD）分析确认了ZIF-8和HRP@ZIF-8的结构完整性。

图3与特定抗体结合的高度稳定的HRP@ZIF-8信号探针

【体外检测唾液中的COVID-19相关蛋白】

在高粘度的液体活检样本中，分子的扩散速率可能会降低，这可能影响液体活检溶液与生物传感器表面的均匀接触。这种现象随后会影响生物传感器捕获目标生物标志物的效率。因此，本文引入了一种基于MNP的SenBox，用于在粘稠的液体活检（图4A）中进行超灵敏、便捷和快速的检测。图4B所示结果表明，当没有重组RBD时，AbRBD-HRP@ZIF-8在与AbRBD@MNP孵育后没有剩余。相反，当存在1 ng/mL浓度的重组RBD时，在AbRBD@MNP上观察到显著量的AbRBD-HRP@ZIF-8。即使在RBD浓度低至1 pg/mL的情况下，仍可以在AbRBD@MNP上观察到AbRBD-HRP@ZIF-8的痕迹。

图4 基于MNP的SenBox与便携式ColorReader集成示意图，用于快速、现场护理中高粘度唾液的蛋白质生物标志物检测

通过使用分光光度计分析反应后溶液的A450nm值来计算液体活检中的生物标志物浓度是一种成熟且广泛接受的方法。使用基于MNP的SenBox与微孔板分光光度计生成的抗SARS-CoV-2 NP IgA抗体、RBD、SARS-CoV-2 Delta S1P和SARS-CoV-2 Omicron S1P的标准曲线验证了A450nm值与这些生物标志物浓度之间的正相关性（图4C）。为证明便携式ColorReader可以替代微孔板分光光度计用于未来的移动医疗量化，本文分析了使用便携式ColorReader获得的比色b值（其中较高的b值表示更明显的黄色）与使用微孔板分光光度计获得的A450nm值之间的相关性。结果表明，b*值和A450nm值之间具有高度的正相关性（r2 = 0.994），从而验证了便携式ColorReader在量化粘稠唾液样本中抗SARS-CoV-2 NP IgA抗体、RBD、SARS-CoV-2 Delta S1P和SARS-CoV-2 Omicron S1P浓度时的可靠性（图5A）。因此，本文评估了基于MNP的SenBox通过便携式ColorReader检测抗SARS-CoV-2 NP IgA抗体和SARS-CoV-2 S1P的线性检测范围。标准曲线显示，抗SARS-CoV-2 NP IgA抗体检测在25 pg/mL至1,000 pg/mL范围内呈线性（r2 = 0.996），SARS-CoV-2 S1P检测也在25 pg/mL至1,000 pg/mL范围内呈线性（r2 = 0.997）（图5B）。

图5比色法b*值与A450nm值之间的相关性展示了便携式ColorReader的精确性

【在大鼠模型中对CFA诱导炎症的细胞因子进行检测和定量】

为了展示基于MNP的SenBox的广泛适用性，本文的目标是证明它不仅可以用于无创针上检测液体活检样本中的蛋白质生物标志物，还可以直接检测皮肤表皮层内的蛋白质生物标志物。在生物医学研究和临床应用中，频繁和及时地测量蛋白质生物标志物对疾病监测和诊断至关重要。然而，传统的纵向测量需要在短期内频繁抽血，这可能导致医源性贫血并增加患者的发病率。此外，对小型实验动物反复抽血往往是不切实际的，可能会导致它们死亡。为此，在完全弗氏佐剂（CFA）诱导的局部炎症大鼠模型中，检测了皮肤表皮层内的细胞因子（TNF-α和IL-1β）。使用基于MNP的SenBox，可以在同一只大鼠中频繁、敏感且准确地进行细胞因子（TNF-α和IL-1β）的纵向测量，使我们能够在不需要血液采样的情况下监测细胞因子水平和免疫系统随时间的变化（图6A）。本文使用TNF-α捕获抗体（AbTNF-α, A0277, ABclonal Inc., USA）或IL-1β捕获抗体（AbIL-1β, A16288, ABclonal Inc., USA）功能化的MNP（AbTNF-α@MNP或AbIL-1β@MNP）以及AbTNF-α或AbIL-1β功能化的HRP@ZIF-8（AbTNF-α-HRP@ZIF-8或AbIL-1β-HRP@ZIF-8）来测量皮肤表皮层内大鼠TNF-α和IL-1β的浓度。为了实现定量分析，通过便携式ColorReader评估了基于MNP的SenBox对TNF-α（RP01322, ABclonal Inc., USA）和IL-1β（RP01788, ABclonal Inc., USA）的线性检测范围。标准曲线显示，对于TNF-α（r2 = 0.99）和IL-1β（r2 = 0.99），在10 pg/mL到3,000 pg/mL范围内具有良好的线性关系，TNF-α的最低检测限（LOD）为4.5 pg/mL，IL-1β的LOD为9.4 pg/mL（图6B）。此外，本文将基于MNP的SenBox与其他已发表的研究和用于TNF-α和IL-1β检测的既定黄金标准方法的线性范围和检测限进行了总结比较，以突出本文的MNP基SenBox在生物传感技术背景下检测炎症标志物的相对优势和局限性。

图6 由CFA注射引起的炎症水平、细胞因子（TNF-α和IL-1β）生成以及基于MNP的SenBox用于纵向检测的工作原理

在进行动物研究之前，首先进行了体外实验，以确定使用基于MNP的SenBox进行皮肤表皮层内蛋白质快速体内捕获和针上分析的可行性。本文将功能化的MNP应用于添加了细胞因子的琼脂糖凝胶中，并保持5分钟不受干扰。将MNP从琼脂糖凝胶中取出后，使用SenBox进行针上分析，以确定TNF-α和IL-1β的浓度。结果表明，AbTNF-α@MNP或AbIL-1β@MNP能够穿透琼脂糖凝胶以捕获添加的TNF-α或IL-1β，并且其b值随着添加的TNF-α和IL-1β浓度的增加而增加（图6C）。最后，在Sprague-Dawley大鼠的皮肤上皮内注射CFA（含有1 mg/mL的分枝杆菌成分）来诱导皮肤炎症。在CFA诱导的炎症大鼠背部皮肤的不同部位（炎症部位和远离炎症部位的远端部位）施用AbTNF-α@MNP和AbIL-1β@MNP，保持5分钟不受干扰，以捕获皮肤表皮层内的TNF-α和IL-1β，随后使用SenBox进行针上分析（图7A）。移除MNP后，皮肤上的微针痕迹清晰可见，但由于应用了MNP。然而，这些凹痕很快消失，皮肤在15分钟内恢复至正常状态，没有明显的红斑、水肿或其他不良反应（图7B）。从健康大鼠的背部皮肤以及CFA诱导的炎症大鼠背部皮肤远离炎症部位的皮肤上回收的MNP，随后在体外使用AbTNF-α-HRP@ZIF-8或AbIL-1β-HRP@ZIF-8探针进行检测，以使用SenBox定量测定TNF-α和IL-1β的浓度。与阴性对照相比，未观察到b值的显著差异。相反，在CFA诱导的炎症大鼠背部皮肤炎症部位的MNP针上分析后，观察到显著的黄色着色和明显更高的b*值。根据标准曲线（使用已知浓度的TNF-α和IL-1β暴露于AbTNF-α@MNP和AbIL-1β@MNP获得），确定了大鼠炎症部位表皮组织中TNF-α和IL-1β的浓度分别在330.3–1348.4 pg/mL和1450.1–2682.7 pg/mL范围内（图7C和7D）。结果进一步通过商用分光光度计验证，该仪器用于测量生成的信号并确定表皮组织中TNF-α和IL-1β的浓度。这种微创的基于MNP的SenBox是进行频繁、敏感和准确测量皮肤表皮层内蛋白质生物标志物的变革性方法。

图7 CFA注射前后大鼠的代表性照片

【总结与展望】

总之，本文开发了一种基于MNP的SenBox的综合生物传感技术，结合了生物矿化增强的比色分析，能够通过体外或直接体内生物传感检测各种液体活检类型中的蛋白质生物标志物。结合便携式ColorReader，该系统能够定期量化液体活检中蛋白质含量的变化，从而促进纵向监测。利用SARS-CoV-2感染早期患者的唾液样本和皮肤炎症大鼠模型，本文证明基于MNP的SenBox可以简便且及时地检测液体活检中的相关蛋白质生物标志物。尽管基于MNP的SenBox提供了一种便携式、微创的蛋白质生物标志物检测解决方案，但尚未为连续监测或使用单个MNP进行多重生物标志物检测进行优化。未来的改进可以集中在增强其连续监测能力，实现多重检测，扩展可检测分析物的范围，并集成无线通信以实现实时数据传输，从而促进更广泛的临床应用和即时诊断。尽管如此，基于MNP的SenBox MHCT已经在多种疾病的应用中展示了巨大潜力，特别是在移动医疗和资源有限的环境中，以患者友好的方式实现快速疾病诊断和有效的治疗干预。

来源：EngineeringForLife