摘要：颅颌面骨缺损的修复比四肢骨缺损的修复更具挑战性，因为需要兼顾功能和美观。目前，干细胞引导的再生医学是颅颌面骨缺损修复最有前景的治疗策略。因此，鉴定特定的颅颌面骨骼干细胞(CMSSC)将有助于开发颅颌面骨再生的干细胞疗法。

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颅颌面骨缺损的修复比四肢骨缺损的修复更具挑战性，因为需要兼顾功能和美观。目前，干细胞引导的再生医学是颅颌面骨缺损修复最有前景的治疗策略。因此，鉴定特定的颅颌面骨骼干细胞(CMSSC)将有助于开发颅颌面骨再生的干细胞疗法。

近日，来自四川大学华西口腔医院的廖立/田卫东＆四川大学蔡浩洋团队描述了人类胚胎下颌骨的单细胞图谱，并鉴定出颅颌面骨骼干细胞(CMSSC)群。这些CMSSC以干扰素诱导的跨膜蛋白5(IFITM5)为标志，具体位于颌骨和额骨的骨膜周围。此外，这些CMSSC表现出强大的自我更新和成骨分化能力，但软骨分化能力较低，介导膜内骨形成而不形成软骨。在成人颌骨中也观察到IFITM5+细胞，其功能与胚胎CMSSC相似。因此，本研究确定了参与颅颌面骨膜内骨化的CMSSC，为深入了解颅颌面骨骼发育提供了依据，也为骨修复提供了有希望的种子细胞。

相关研究成果以“Identification of human cranio-maxillofacial skeletal stem cells for mandibular development”为题于2025年1月1日发表在《Science Advance》上。

1.人类下颌骨发育过程中单细胞转录组的综合分析

为了研究人类下颌骨形态发生过程中迁移后CNCC的命运决定，在妊娠第8 周(GW8)、GW9、GW9.5、GW10和GW11分离人类胚胎下颌骨,然后将下颌骨样本消化成单细胞悬浮液。使用scRNA-seq分析单个细胞的转录组（图1A）。将所有样本中的细胞整合起来，并使用无监督聚类和标记分析将其分为13个细胞群（图1B）。所有亚群中特征基因的点图表明了聚类结果的可靠性（图1C）。Pearson相关性分析显示间充质细胞和非间充质细胞分别聚集在一起。

为了研究CNCC的动态多分化轨迹，将间充质细胞簇圈起来，并使用Monocle 3进行拟时间分析（图1D）。预测的轨迹表明，CNC衍生的间充质细胞的连续命运决定最初分化为三个方向，一个方向向神经元谱系发展，一个方向向基质谱系发展，一个方向成为共同祖细胞。然后，共同祖细胞进一步分支为三个不同的谱系：RUNX2+成骨谱系、SOX9+软骨谱系和LHX6+牙源性谱系。与拟时间分析结果一致，CNC衍生的间充质细胞（POSTN和SFRP2）中的特征基因在终末分化时逐渐下调，而神经元谱系（NRG1和NRCAM）、基质谱系（TWIST2和CXCL14）、软骨谱系（SOX9和COL2A1）和成骨谱系（RUNX2和MSX1）中的特征基因则随着向不同谱系的分化而逐渐上调（图1E）。基因本体论（GO）分析也显示，共同祖细胞和成骨细胞中富集了参与调控骨化过程的基因，而软骨细胞中富集了参与软骨凝聚的基因，这支持了上述聚类结果（图1F）。

图1 人类胚胎下颌骨的综合细胞图谱

2.通过scRNA-seq与LCM-seq结合鉴定颅颌面SSC

scRNAseq已经在下颌骨发育过程中鉴定出成骨细胞亚群，作者进一步尝试在单细胞图谱中鉴定出骨化中心的CMSSC。为了提供scRNA-seq鉴定出的亚群的原始空间位置信息，进行了LCM-seq（图2A）。凝固的CMSSCs紧密粘附在骨膜上，分离了GW9至GW12人类下颌骨的梅克尔软骨细胞(MCC)（图2B），并从LCM解剖区域生成了高质量的全长转录组。使用火山图分析和可视化CMSSCs和MCCs的差异表达基因(DEG)（图2C）。GO分析显示MCCs和CMSSCs中的DEG分别参与软骨发育和骨化（图2D-E）。其中，MCC中DEG排名前两位的基因COL2A1和COL9A1在软骨细胞中表达显著，CMSSC中DEG排名前两位的基因ASPN和OGN在成骨细胞和共同祖细胞中高表达（图2F）。LCM-seq的结果与scRNA-seq的结果一致，表明LCM-seq结果的可靠性。为了明确CMSSC在scRNA-seq图谱中的分布，将LCM-seq数据转换为稀疏矩阵作为伪单细胞数据，结果表明CMSSCs1至CMSSCs5完全与成骨谱系整合，表明CMSSCs是成骨谱系细胞。

为了寻找CMSSC的特异性表面标志物，将CMSSC中的DEG（249个基因，来自LCM-seq）和成骨细胞中的DEG（465个基因，来自scRNA-seq）相交，得到83个重叠基因，其中包括17个编码膜蛋白的基因（图2H）。这17个基因按照成骨细胞中DEG的顺序排列。选择前五个基因并在均匀流形近似和投影(UMAP)图中描绘（图 2I）。其中，IFITM5在CMSSC中特异且差异表达。

图2 人类胚胎下颌骨中CMSSC的表征以及将IFITM5鉴定为CMSSC的表型标志

3.IFITM5与人类下颌骨已知标志物的空间关系

为了确定IFITM5与其他已知标记物的空间关系，在GW9和GW10下颌骨中将IFITM5与增殖标记物(Ki67)、SSC 标记物(Ctsk、Gli1和Gremlin1)、间充质细胞标记物(Prrx1和Dlx5)和成骨标记物(RUNX2)共染色(图3A-B)。免疫荧光染色显示大量IFITM5+细胞与Ki67共表达，表明它们处于活跃的增殖状态。IFITM5+群体在骨膜周围特异性表达，并强烈共表达典型的SSC标记物和间充质细胞标记物。此外，骨基质中的RUNX2+细胞未被IFITM5标记。这些荧光结果表明IFITM5可能是标记人胚胎下颌骨中CMSSC的特异性表面标志物（图3）。

图3 IFITM5与其他已知标记的免疫荧光共定位

4.IFITM5+ CMSSC在早期膜内骨化过程中具有组织特异性

接着，作者使用先前研究的数据将人类胚胎下颌骨的细胞谱系（常见祖细胞、成骨细胞和软骨细胞）与其他骨组织的间充质细胞整合在一起。在受孕后8周(WPC)的人类颅骨中发现了IFITM5+亚群，其基因表达谱（DLX5、RUNX2和IFITM5）与CMSSC相似（图4A）。然而，在8-WPC人类长骨（图4B）和GW9人类椎骨（图4C）中几乎没有检测到IFITM5+亚群。

同样，IFITM5表达在人类下颌骨发育过程中出现较晚，因为在第8周未检测到。这表明IFITM5+ CMSSC参与了下颌骨的形成，并且这种发育模式在物种间是保守的。免疫荧光分析表明，在GW9人类额骨的骨膜中可以观察到IFITM5+细胞（图4E）。在GW9人类长骨和椎骨的软骨膜中未检测到IFITM5+细胞（图4F-G），这表明CMSSC与在长骨中发现的Ctsk+细胞不同。总之，这些结果表明IFITM5+细胞有助于颅颌面骨的膜内骨化。

图4 不同地点和跨物种的CMSSC比较

5.CMSSC表现出更高的增殖和矿化能力，但软骨分化能力较低

接下来，从胚胎下颌骨中分离IFITM5+细胞以进行干细胞表征。IFITM5+细胞占胚胎下颌骨的4.26%。使用流式细胞术分离IFITM5+细胞，采用Zombie−（用于排除死细胞）CD31−CD45−CD235ab−（用于排除内皮细胞和造血细胞）和IFITM5+的门控策略（图5A-B）。为了测试IFITM5+细胞的自我更新能力，对IFITM5+单细胞进行分选以进行连续菌落形成试验。单个IFITM5+细胞可以克隆扩增并连续传代，产生次级和三级菌落（图5C）。与IFITM5-细胞相比，IFITM5+细胞的菌落形成效率和大小更高（图5D-E）。接下来，在克隆培养物上进行体外三系分化试验，IFITM5+细胞表现出比IFITM5-细胞更强的成骨能力但更低的软骨形成能力（图5F-I）。但两组均未发现明显的脂滴形成（图5J和K）。这些数据表明IFITM5+细胞是具有自我更新和成骨分化能力的寡能SSC。为进一步检测细胞在体内的分化潜能，将IFITM5+和IFITM5-细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾包膜下区域和大鼠下颌骨缺损区域（图5L-T）。一系列测试结果表明，CMSSCs在颌骨和长骨修复中均具有强大的骨再生能力，表明其具有更广泛的治疗潜力。

图5 CMSSCs的表型和功能特征

6.与长骨中的SSC相比，CMSSC在下颌骨缺损中具有更强的再生能力

此外，为了进一步探索它们在颌骨缺损中的再生性能，在小鼠下颌骨上建立了一个直径为1毫米的缺损模型，并移植了IFITM5+ CMSCC和CADM1+ SSC。移植两周后，microCT的3D重建和矢状图显示IFITM5+ CMSCC 组生成了更多的骨小梁（图6G）。BV/TV、Tb.Th和Tb.Sp的定量分析证实了重建图像的观察结果（图6H）。此外，H&E 染色组织学图像证实了micro-CT的发现（图6I）。结果表明，IFITM5+群体比长骨SSC表现出更好的再生潜力。

图6 评估IFITM5+细胞和CADM1+细胞的自我更新和成骨能力

7.IFITM5+细胞存在于成人下颌骨中并表现出强大的骨再生能力

来自胚胎的CMSSC表现出强大的骨再生能力。然而，由于资源有限和伦理争议，胚胎CMSSC不被视为组织再生的种子细胞。这项研究证明了IFITM5+细胞在成人颌骨中的存在（图7）。成人IFITM5+BMSC在体外表现出强大的成骨和脂肪形成分化能力，这与含有脂肪组织的成人下颌骨的组织学特征一致。

图7 成人下颌骨中IFITM5+细胞的检测和功能验证

综上，本研究描绘了人类胚胎下颌骨的细胞图谱，并在早期膜内骨化过程中鉴定出一种特定的IFITM5+ CMSSC。IFITM5+ CMSSC表现出强大的自我更新、成骨分化和骨缺损修复能力。此外，在成人下颌骨中检测到了IFITM5+细胞，表现出与骨组织修复相似的特性。这些发现可以提高对早期人类下颌骨发育的理解，并提供了新的替代干细胞来促进骨再生和治疗骨骼疾病，包括骨折和退行性骨骼疾病。

来源：EngineeringForLife