肌动蛋白Actin染色步骤详解

摘要：肌动蛋白Actin在活细胞中是一种动态、易变的结构。Actin的染色可用于确定固定细胞和活细胞中细胞骨架的结构和功能。Cytoskeleton作为细胞骨架和小G蛋白研究专家，可提供全面的骨架蛋白染色试剂及方案。接下来，小优分别给大家介绍固定细胞和活细胞中Act

转自：优宁维抗体专家

肌动蛋白Actin在活细胞中是一种动态、易变的结构。Actin的染色可用于确定固定细胞和活细胞中细胞骨架的结构和功能。Cytoskeleton作为细胞骨架和小G蛋白研究专家，可提供全面的骨架蛋白染色试剂及方案。接下来，小优分别给大家介绍固定细胞和活细胞中Actin的染色步骤。

2025年1月1日-2月25日Cytoskeleton热销爆品直降54折。本次促销包含Actin染色探针及聚合物检测试剂盒、蛋白翻译后修饰Signal Seeker检测试剂盒、高纯度Tubulin蛋白及聚合检测试剂盒、小G蛋白的GTP结合活性测定试剂盒等。

一、固定细胞中的Actin染色步骤

在固定细胞中，肌动蛋白结构可通过荧光鬼笔环肽（phalloidins）、肌动蛋白抗体来观察：荧光鬼笔环肽只与F-actin的原生四级结构结合，所以具有低背景。抗体识别单体和多聚体肌动蛋白（丝状或F-actin），因此与仅结合F-actin的荧光鬼笔环肽相比，往往具有高背景。另外确保使用适当的固定剂以保持Actin的天然结构至关重要，在使用荧光鬼笔环肽进行actin染色时，推荐使用多聚甲醛作为固定剂，因为多聚甲醛能够保留Actin的四聚体结构，有利于高亲和力结合荧光鬼笔环肽；避免使用冷甲醇，因为甲醇会破坏Actin的天然构象，不利于与荧光鬼笔环肽结合。

1) 将3.5 μl荧光鬼笔环肽储备液（14 μM）稀释到500 μl PBS中，制备成100 nM的 Acti-Stain 488 Phalloidin工作液。室温下避光保存；

2) 取出含有细胞的盖玻片（细胞汇合度50%左右，可视细胞类型优化）；

3) 弃去培养基，用PBS轻轻洗一次细胞（室温）；

4) 将盖玻片转移到湿盒中，每张盖玻片上滴加200 µl固定液（含3.7%多聚甲醛的PBS，pH=7.0），室温固定10 min；

5) 用PBS轻轻冲洗细胞30 s（室温）；

6) 每张盖玻片上滴加200 µl通透剂（含0.5 % Triton X-100的PBS），于湿盒中室温通透5 min；

7) 用PBS轻轻冲洗两次细胞，每次30 s（室温）；

8) 滴加200ul 100 nM的Acti-Stain 488 Phalloidin工作液，于湿盒中室温避光孵育30 min；

9) 用PBS冲洗盖玻片三次，每次30 s（室温）；

10) （可选）滴加200ul 含100 nM DAPI的PBS，室温染色30 s；

11) （可选）用PBS冲洗盖玻片30 s（室温）；

12) 用纸巾轻轻擦去盖玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂；

13) 静置20 min晾干，然后用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24 h。

图1：使用Acti-Stain 488 Phalloidin对Swiss 3T3细胞进行actin染色。整个细胞中actin被染成绿色（图源产品说明书）。

文中部分相关产品：

Acti-stain™ 488 Phalloidin，PHDG1-A（非常稳定的绿色荧光，用于固定细胞Actin染色）

Rhodamine Phalloidin，PHDR1（红色荧光，用于固定细胞Actin染色）

Acti-stain™ 555 Phalloidin，PHDH1-A（非常稳定的红色荧光，用于固定细胞Actin染色）

Acti-stain™ 670 Phalloidin，PHDN1-A（远红色荧光，用于固定细胞Actin染色）

1) 取出含有细胞的盖玻片（细胞汇合度50%左右，可视细胞类型优化）；

2) 弃去培养基，用PBS轻轻洗一次细胞（室温）；

3) 将盖玻片转移到湿盒中，每张盖玻片上滴加200 µl固定液（甲醇），室温固定10 min；

4) 用PBS轻轻冲洗细胞2次，每次30 s（室温）；

5) 每张盖玻片上滴加200 µl通透剂（含0.5 % Triton X-100的PBS），于湿盒中室温通透15 min；

6) 用PBS轻轻冲洗两次细胞，每次30 s（室温）；

7) 每张盖玻片上滴加200 µl含0.1% BSA、0.3M glycine的PBST（PBS+0.01% tween），于湿盒中室温封闭1 h；

8) 每张盖玻片上滴加200 µl Anti-Pan Actin Mouse Monoclonal Antibody（1:250-1:500，PBS稀释），于湿盒中室温孵育90 min；

9) 使用含有0.1%Triton X-100的PBS轻轻冲洗细胞30 s；

10) 用PBST冲洗盖玻片三次，每次30 s（室温）；

11) 每张盖玻片上滴加200 µl荧光二抗（稀释比例参考对应抗体说明书）于湿盒中室温孵育60 min（尽量减少光照）；

12) 用PBS冲洗盖玻片3次，每次30 s（室温）；

13) （可选）每张盖玻片上滴加200 µl DAPI（稀释比例和孵育时间参考对应说明书）,于湿盒中室温孵育20 min（尽量减少光照）；

14) （可选）用PBS冲洗盖玻片3次，每次30 s（室温）；

15) 用纸巾轻轻擦去盖玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂；

16) 静置20 min晾干，然后用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24 h。

注意：使用此抗体（Anti-Pan Actin Mouse Monoclonal Antibody，Cat. # AAN02）进行actin染色时不建议使用多聚甲醛固定细胞，建议使用甲醇或多聚甲醛/甲醇固定细胞；而荧光鬼笔环肽染色actin建议使用的固定剂是多聚甲醛（图2）。

图2：不同固定剂对荧光鬼笔环肽、actin抗体的影响（图源产品说明书）。

文中部分相关产品：

Anti-Pan Actin Mouse Monoclonal Antibody，AAN02

Alexa Fluor® 488-conjugated AffiniPure™ Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，115-545-003

Fluorescein (FITC)-conjugated AffiniPure™ Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，115-095-003

Alexa Fluor® 594-conjugated AffiniPure™ Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，115-585-003

Cy3-conjugated AffiniPure™ Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，115-165-003

二、活细胞中的Actin的染色步骤

在活细胞中，可以通过加入荧光标记的肌动蛋白、表达GFP-actin或荧光标记的肌动蛋白结合蛋白亚域来观察肌动蛋白结构。荧光肌动蛋白是最准确的肌动蛋白结构报告物，可通过显微注射或蛋白质转染试剂将其装入细胞。

1) 用通用型肌动蛋白缓冲液将罗丹明肌动蛋白重悬至2 mg/ml，并添加0.2 mM ATP和1 mM DTT。在冰上放置1小时使肌动蛋白低聚物解聚。注：如果钙离子影响细胞，罗丹明肌动蛋白可在纯水中重悬；

2) 将罗丹明肌动蛋白溶液在14000 ×g 4°C下离心10分钟（或100000 ×g 4°C下离心10分钟）。将上清液的90%移至新的EP管中，通过毛细管作用将显微注射针装入；

3) 将罗丹明肌动蛋白微量注射到细胞内，保持针内正压，防止堵塞。注意：组织培养基和细胞质中的盐可导致针内肌动蛋白聚合；

4) 在温控显微镜平台上使用较低强度的光和CCD摄像机观察细胞。

文中部分相关产品：

Actin protein (rhodamine, rabbit skeletal muscle)，AR05

Actin protein (rhodamine, human platelet non-muscle)，APHR

2014年5月25日，Nature Methods杂志发表了一篇具有里程碑意义的论文，介绍了细胞渗透性和无毒性活细胞成像探针（SiR-Actin和SiR-Tubulin）。SiR-actin是一种用于活细胞中F-actin标记的荧光探针。它结合了荧光基团硅罗丹明（silicon rhodamine, SiR）和天然产物jasplakinolide，后者是一种可以稳定F-actin的大环肽天然产物。SiR-actin能够在活细胞中特异性地标记F-actin，并且具有低背景。