摘要：含氟化合物在医药、农药和化工领域具有举足轻重的地位。据统计，超过 20% 的药物分子包含至少一个氟原子，而在所有含氟官能团中，三氟甲基 (CF3) 因其独特的物理化学性质和广泛的药物应用，尤为重要。过去几十年间，有机氟化学取得了显著进展，为三氟甲基化学的合成提

含氟化合物在医药、农药和化工领域具有举足轻重的地位。据统计，超过 20% 的药物分子包含至少一个氟原子，而在所有含氟官能团中，三氟甲基 (CF3) 因其独特的物理化学性质和广泛的药物应用，尤为重要。过去几十年间，有机氟化学取得了显著进展，为三氟甲基化学的合成提供了多样化的策略。这些方法极大地推动了含三氟甲基化合物的设计与制造。然而，与化学催化的飞速发展相比，生物催化在氟化学，尤其是三氟甲基化学领域的研究明显滞后，无论是反应范围还是机理多样性均远远落后。近年来，少量关于酶催化引入氟烷基的研究逐渐涌现（图1a）。例如通过设计可介导氟烷基取代的 S-腺苷-L-甲硫氨酸 (SAM) 类似物，实现酶催化的氟烷基化反应。通过含血红素蛋白的定向进化实现氟烷基取代的卡宾转移反应，包括环丙烷化、C-H键氟烷基化以及B-H键和N-H键插入等反应。以及利用光驱动的烯烃还原酶催化烯烃的氟烷基化。此外，最近还发展了一种化学-酶联合催化策略，通过铜催化生成三氟甲基自由基，再结合漆酶活化富电子芳环，实现三氟甲基化反应（图1b）。尽管上述研究展示了酶催化引入氟烷基的可行性，但这些方法主要集中于非三氟甲基的氟烷基基团的构建，而通过酶催化直接构建 C(sp3)‒CF3 键仍然是一个未被解决的重大挑战。这一难题的克服将为含氟化合物的生物催化合成开辟新的方向。

图1

约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组近期开发了一种创新性的金属酶催化反应体系，成功将金属羟化酶工程化为能够催化烯烃双官能团化的酶，首次实现了对映选择性的烯烃三氟甲基叠氮化反应（图1c）。这一突破性研究不仅扩展了金属酶催化的化学反应范围，还为生物催化在复杂含氟化合物的合成中开辟了新途径。此研究的核心在于构建一个能够活化高价碘试剂（如 Togni 试剂 II）的金属酶催化体系，以产生三氟甲基自由基。高价碘试剂的还原活化是合成化学中常见的自由基生成方法，但此前从未在生物催化体系中得到应用。通过精心设计和酶工程优化，该研究成功将这一化学活化模式引入到生物催化中，实现了以下两个重要突破：（1）创造了第一个能够直接构建 C(sp3)‒CF3 键的金属酶催化体系，为含三氟甲基化合物的酶催化合成提供了新范式；（2）首次实现了高价碘试剂在生物催化反应中的还原活化，建立了一个全新的自由基酶催化反应平台，为进一步开发多样化的基于高价碘试剂的自由基反应奠定了基础。

图2

为了实现烯烃三氟甲基叠氮化反应，黄雄怡课题组基于其在金属酶催化不对称自由基转化方面的研究经验，提出如下反应设计：非血红素铁酶的还原态 Fe(II) 活性中心与 Togni 试剂 II 发生单电子氧化还原，生成三氟甲基自由基；该自由基与烯烃底物 3 发生加成反应，形成自由基中间体 4；随后，中间体 4 与 Fe(III)-N3 中间体（Science, 2022, 376, 869, 点击阅读详细）发生自由基转移反应，最终生成对映选择性的三氟甲基叠氮化产物（图2）。

图3

基于这一反应设想，研究者以苯乙烯 (3a) 作为模型底物，叠氮化钠 (NaN3) 作为叠氮源，Togni 试剂 II (1a) 作为三氟甲基化试剂，对一系列野生型非血红素铁酶的催化活性进行了筛选。为了提高筛选效率，酶的表达和反应均在 96 孔板中以全细胞形式进行。筛选结果显示，来源于 Amycolatopsis orientalis 的羟基扁桃酸合酶 (AoHMS) 表现出最高活性，能以 4% 的产率生成三氟甲基叠氮化产物 5a（图3a）。进一步测试多种取代苯乙烯底物后，研究者选择 4-甲氧基苯乙烯 (3b) 作为新的模型底物。由于 3b 为富电子底物，研究者推测其能够更有效地促进三氟甲基自由基的加成反应，从而有助于反应优化。以 3b 为底物，研究团队筛选了实验室已有的 AoHMS 突变体酶库，并发现了一个六重突变体 AoHMS-QGHLYV（F188Q/T214G/Q305H/F307L/F330Y/I335V）。与野生型相比，该突变体表现出显著更高的活性和对映选择性，能够以 14% 的产率和 69:31 的对映体比例生成产物 5b。基于 AoHMS-QGHLYV 突变体，研究者进一步优化了反应条件。在细胞裂解液中进行反应，产率提高至 31%。为了进一步提高催化性能和对映选择性，研究团队对 AoHMS-QGHLYV 突变体（简称 “P”）进行了定向进化。为加速筛选过程，他们开发了一种基于 Staudinger 连接反应 的高通量筛选（HTS）系统（图3b）。这一系统利用荧光素基探针可选择性检测有机叠氮化物生成的产物，即使在高浓度 NaN3 存在的情况下，仍可释放荧光素作为报告分子，进行高效定量分析。这一策略避免了传统点击化学中需要加入铜催化剂的副反应，简化了操作流程，同时提高了筛选效率，为大规模突变体筛选提供了可靠的工具。

图4

在 HTS 系统支持下，作者对 “P” 突变体进行了多轮单点和双点位饱和突变（SSM）。筛选结果表明，一个七重突变体 AoHMS-V6（S201V、N334S、E190D、L338A、Y339V、S332G 和 G328S）显著提高了反应性能，将对映选择性从 69:31 提升至 91:9 e.r.，同时略微提高了催化活性。为进一步扩展序列空间，作者采用随机突变方法，最终发现一个三重突变体 AoHMS-V7（P173L、D228N 和 A269T），对映选择性进一步提升至 92:8 e.r.。值得注意的是，这些突变位点均位于溶剂暴露区域，且远离活性位点，提示它们可能通过调整蛋白质整体构象间接影响催化性能。以 AoHMS-V7 为基础，研究者进行了另一轮定点饱和突变，筛选出包括 V342A、Q226P 和 L303M 在内的三个位点突变，构建了最终的优势突变体 AoHMS-CF3。与野生型 AoHMS 相比，该最终变体包含 19 个突变，能够以 53% 的产率 和 95:5 e.r. 的对映选择性高效生成产物 5b。通过进一步优化反应条件，产率可进一步提高至 67%（图4）。

图5

在获得最优突变体 AoHMS-CF3 后，研究团队系统考察了酶促烯烃三氟甲基叠氮化反应的底物适应性，展现了这一体系的广泛兼容性和潜力（图5）。研究发现，富电子型烯烃相比缺电子型烯烃表现出更高的反应活性。这表明电子效应对三氟甲基自由基的加成步骤起到关键作用。常见官能团（如烷氧基、硝基和卤素基团）在反应中均表现出良好的耐受性，表明该体系具有一定的官能团兼容性，适用于功能化分子的改造。该体系对一系列二取代苯乙烯底物展现了优异的兼容性。相应的三氟甲基叠氮化产物的收率在 25% 至 64% 之间，对映选择性（e.r.）范围为 62:38 至 96:4。这一结果表明，酶催化体系能够有效处理复杂的取代模式，并在保持高对映选择性的同时实现较高的转化率。杂芳烃如乙烯基吡啶类底物也被成功转化，产物收率在 35% 至 80% 之间，对映选择性为 61:39 至 85:15 e.r.。这表明该体系对杂环底物的适应性较强。令人瞩目的是，该反应体系能够有效处理未活化烯烃底物。如 4-烯丙氧基苯甲醚，能以 28% 的收率 生成三氟甲基叠氮化产物 5u，对映选择性达到 79:21 e.r.。这一结果展示了酶催化反应在挑战性底物上的潜力，为非传统底物的转化提供了可能性。

图6

该生物催化反应体系具有良好的可扩展性（图6）。例如，在 0.5 mmol 的反应规模下，三氟甲基叠氮化产物的分离产率高达 67%，对映选择性达到 95:5 e.r.，充分证明了该方法的实用性和放大生产的潜力。该体系生成的叠氮化产物具有高度可衍生化的特性，显著拓展了其应用潜力。例如，产物 5b 通过 CuAAC 点击化学反应 与炔类化合物反应，可生成三唑化合物 6b。此衍生化产物的分离产率为 55%，对映选择性保持在 95:5 e.r.。这一结果表明，该生物催化反应体系不仅能够生成高对映选择性的中间体，还为复杂分子的后续合成提供了高效便捷的途径。值得一提的是，该酶催化体系具有高度模块化的特性，其碘(III)活化机制不仅限于三氟甲基自由基，还可以扩展至其他类型的自由基, 例如，将 Togni 试剂 1a 替换为五氟乙基碘(III)试剂时，反应生成五氟乙基叠氮化产物 7b。其分离产率为 21%，对映选择性为 90:10 e.r.，表明该体系对不同氟烷基自由基具有一定的通用性。以叠氮苯碘唑酮（Zhdankin 试剂）作为自由基前体时，反应生成双叠氮化产物 8b，其分离产率为 12%，对映选择性为 67:33 e.r.。尽管对映选择性略有下降，该结果展示了体系在多功能自由基反应中的适应性与潜力，进一步扩展了其化学空间。

小结

本研究创新性地构建了一种金属酶催化体系，用于生成三氟甲基自由基并实现由非血红素铁酶催化的对映选择性烯烃三氟甲基叠氮化反应。这一体系突破了传统酶催化反应的局限性，为有机氟化学领域提供了全新的生物催化解决方案。本研究的成功不仅为三氟甲基化反应提供了高效且对映选择性强的酶催化方法，还为进一步拓展酶催化有机氟化学的研究范围奠定了基础。

Biocatalytic Generation of Trifluoromethyl Radicals by Nonheme Iron Enzymes for Enantioselective Alkene Difunctionalization

James G. Zhang, Anthony J. Huls, Philip M. Palacios, Yisong Guo*, Xiongyi Huang*

J. Am. Chem. Soc., 2024, 146, 34878-34886, DOI: 10.1021/jacs.4c14310

来源：X一MOL资讯