摘要：据国际癌症研究机构对185个国家的癌症数统计，癌症死亡逐年升高。癌症死因依次为肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌和胃癌[1]。化疗作为目前癌症治疗的主流手段，可提高患者的生存率，但大多数患者会出现恶心、呕吐等不良反应，严重影响患者的生活质量[2]。中药在治疗癌症方面

据国际癌症研究机构对185个国家的癌症数统计，癌症死亡逐年升高。癌症死因依次为肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌和胃癌[1]。化疗作为目前癌症治疗的主流手段，可提高患者的生存率，但大多数患者会出现恶心、呕吐等不良反应，严重影响患者的生活质量[2]。中药在治疗癌症方面具有多成分、多靶点、不易产生耐药等优势，符合肿瘤多因素、多环节致病机制，在治疗上，主要以“扶正和祛邪”为主，在帮助患者克服不良症状方面具有重要作用[3]。此外，中药来源的天然产物可以通过调节多种信号通路发挥抗肿瘤作用，是药物研发的重要来源。目前，长春新碱、长春碱、紫杉烷类和鬼臼毒素等抗癌化合物的临床批准进一步肯定了中药抗肿瘤的巨大价值和潜力[4]。

合适的动物模型是中药筛选、药物作用机制深入研究的重要手段。当前运用较为广泛的是传统鼠、兔肿瘤模型，这些模型虽易于操作且重现性好，但实验周期长，成本高且肿瘤生长过程不易观察。斑马鱼是一种被广泛用于生理学、毒理学和分子遗传学研究的脊椎类动物，生长迅速、造模技术成熟且生长环境易控制，成本相对低廉。在长期的研究中发挥出明显的优势。本文基于斑马鱼模型对中药治疗肿瘤的研究进行综述，为促进斑马鱼模型在中药药效药理研究中的进一步应用及中药抗肿瘤药物的开发提供参考。

1 斑马鱼模拟人类肿瘤疾病的优势

斑马鱼是目前前景广泛的模式生物之一，在组织学和基因组水平上与人类高度相似，具有体积小、易饲养的特点，其简单的形态结构、较大的繁殖量、较短的实验周期，满足了多元化设置实验条件及优化实验方案的需求，也可用于大规模基因筛选和活体高通量药物筛选[5-6]。此外，斑马胚胎适应性免疫系统在7 d后开始发育，直到受精后4～6周在形态和功能上成熟，这种免疫缺陷为植入肿瘤细胞提供了条件[7]。斑马鱼在早期发育过程中具有光学透明性，使其成为体内成像的首选模式生物，通常采用荧光报告基团（GFP、DiI等）对斑马鱼体内细胞、染色体等进行标记，以荧光强度、面积和数量评估药物的直接抗癌效果[8]。

活体成像技术的发展为斑马鱼抗肿瘤药效评价提供了便利。目前使用较为广泛的是共聚焦荧光显微技术，具有操作简单、分辨率高、易实现高通量的特点[9]。而光片流成像系统是一种基于流式光片的高通量显微成像技术，将流式成像技术与光片照明技术相结合，通过设计液流与光学耦合系统，结合精密的进取样控制时序与三维重建算法，可实现高通量3D成像，用于药物的大规模筛选[10]。利用3D重建体内成像，研究者还可以监测癌细胞与斑马鱼血管外表面之间的相互作用，并记录肿瘤细胞沿血管迁移的过程及在此过程中的形态变化[11]。选择性平面照明显微技术可实时可视化肿瘤细胞的特征，并识别不同迁移模式，提供肿瘤特异性迁移速度和距离[12]。单细胞分辨成像技术可动态可视化单个癌细胞的生物表型和药物治疗反应[13]。结合插管技术，可以在倒置显微镜上对成年斑马鱼进行长期成像[14]。荧光探针如近红外荧光探针[15]、双通道荧光纳米探针[16]等的发展，为斑马鱼活体成像提供了有力的工具，可实现斑马鱼体内靶向性成像。这些成像技术的应用，提高了斑马鱼成像的清晰度和准确性，利于全程监测肿瘤生长、转移、新生血管、细胞凋亡等情况。结合图像分析软件，可对斑马鱼体内的肿瘤细胞进行定量计算，评估药物对肿瘤生长的抑制作用[17]。在生物信息学、纳米技术、计算机科学等领域的最新成果不断推动下，斑马鱼肿瘤成像技术得以快速发展并扩大应用领域，实现高通量、快速、同时实验成像，且被广泛用于抗肿瘤药物的筛选。

2 斑马鱼肿瘤模型的建立

斑马鱼肿瘤模型是一种多功能新型活体动物模型，常见的肿瘤模型有诱发模型、移植模型和基因修饰模型（图1）。

2.1 诱发模型

诱发是一种能快速获得斑马鱼肿瘤模型的方法，通过口服、注射、暴露致癌因素的方式诱发斑马鱼发生肿瘤。7,12-二甲基[a]苯并蒽是一种对脊椎动物具有强致癌性的化合物，可通过水溶液浸泡、胚胎微注射处理及饮食给药的方式，诱发斑马鱼发生肿瘤，主要靶器官为肝脏，也可用于诱发胰腺癌[18-19]。其他化合物如二乙基亚硝胺[20]、盐酸多西环素[21]、N-亚硝基二甲胺[22]等也可诱发肝癌。睾丸和血管是N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的主要靶器官，可诱发精子瘤、血管瘤或血管肉瘤等[23]。此外，1,4-苯醌[24]、N-乙基-N-亚硝基脲[25]是白血病常用诱导剂；朝藿定B可用于诱导黑色素瘤等[26]。该类诱导方法操作简单、成本低廉，但易引起非特异性表型、耗时长、发病率低，且肿瘤定位困难，具有一定局限性。

2.2 移植模型

斑马鱼异种移植法常被用于肿瘤的生长和迁移等研究中。异种移植技术是采用微量注射的方法将肿瘤细胞移植到不同发育阶段的斑马鱼的卵黄囊、卵黄周间隙、居维叶导管和后脑室等特定部位，可很好地保持人类肿瘤的原始异质性，该方式被认为是斑马鱼在癌症研究的一大优势。其中，卵黄周间隙是识别新生血管、研究迁移和转移行为的较佳区域和理想注射部位，但该方法的成功率较低，因此，卵黄囊是首选的瘤体接种部位[27]。此外，斑马鱼胚胎和幼体的免疫缺陷使其适用于异种移植，成年斑马鱼可提前使用免疫抑制剂或γ-射线抑制机体的免疫系统，防止移植排斥，或直接使用免疫缺陷斑马鱼品系如rag2等[28-29]。斑马鱼胚胎容易大量获得，允许单次建成大量异种移植模型，可用于高通量药物筛选。现有的斑马鱼肿瘤模型大多通过异种移植构建，常用细胞系包括人肺癌A549细胞[30]、人结直肠癌HCT116细胞[31]、人肝癌HepG2细胞[32]、人乳腺癌MDA-MB-231细胞[33]、人胃癌SGC-7901细胞[34]等。与其他造模方式相比，异种移植模型以其适用性强、操作简单、技术成熟、成功率高、成本低等优点，成为肿瘤研究中常用的斑马鱼模型。

2.3 基因修饰模型

在构建特定组织斑马鱼肿瘤模型时，通过基因编辑或基因操作，可在组织特异性启动子如fabp、krt、kita和mitfa的控制下，精确调控斑马鱼kras、xmrk、ras等癌症基因的表达，从而诱导进化保守的实体瘤，如肝癌、结肠癌和黑色素瘤等，较好地模拟人类的肿瘤性病态[35-39]。此外，作为构建转基因模型的重要工具，基因工程技术主要通过“敲除”一些关键基因或“敲入”与疾病相关的基因改变转录[40]。目前，针对斑马鱼的基因操作技术已经相当成熟，其中成簇的规律间隔的短回文重复序列系统（clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated system，CRISPR/Cas）技术因其高精密、高效等优点而得到广泛应用。通过设计特定的引导RNA和特异性Cas9内切酶，CRISPR/Cas9系统可以在斑马鱼基因组中实现精确切割，从而实现基因的敲除、插入和修饰等操作[41]。转基因斑马鱼肿瘤模型具有较高的可控性，肿瘤发生率高，但操作复杂，存在一定技术难度，且耗时长、成本较高。

3 斑马鱼模型在中药抗肿瘤研究中的应用

斑马鱼肿瘤模型已经被广泛用于探索疾病机制，筛选新的治疗靶点和潜在治疗药物。中药作为抗癌药物重要来源，研究者使用斑马鱼模型对中药提取物、中药单体及中药复方在抗癌方面进行药效学评价，通过相关研究明确其抗癌的作用靶点、信号通路等机制，为现代抗癌药物研发提供新思路，对于深入挖掘中医宝库、探索传统中药的抗癌潜能大有裨益。

3.1 肺癌

郭新邓等[42]利用斑马鱼模型，探讨了连翘饮片水提物和连翘颗粒抗肿瘤药效差异，发现二者均展示出显著的抗A549细胞增殖作用，且无明显差异。Li等[43]通过在斑马鱼体内注射NCI-H2170细胞建立肺鳞癌模型，结合生物信息学分析发现经三叶青醇提物处理后，谷氨酸代谢型受体3 mRNA表达显著增加，而谷氨酸代谢型受体7 mRNA表达显著降低，进一步阐明了三叶青醇提物在斑马鱼模型中抗肿瘤作用的可能作用机制。

中药单体是从中药复杂的成分中分离、提纯的单一化学成分，化学结构清晰，作用效果明确。如苦参碱[44]、麦冬皂苷B[45]、朝藿素B[46]等中药单体对斑马鱼体内A549细胞的增殖均具有抑制作用。Zhang等[47]借助斑马鱼异种移植模型，首次从调节脑微环境的角度描述了虫草素抗小细胞肺癌的机制，发现其主要是通过介导维生素D代谢、脂质转运和蛋白水解失调，调节CYP24a1、apoa1a、ctsl等关键基因的表达，从而起到抑制癌细胞增殖的作用。此外，溪黄草中的疏展香茶菜宁B在斑马鱼体内显示出抗血管生成作用，有助于抑制肿瘤生长和扩散[48]。白花丹中的白花丹素可增加斑马鱼体内肿瘤抑制基因p53的表达，从而促进细胞凋亡[49]。

采用中药复方干预斑马鱼模型可以综合评价方剂或成药多靶点的作用，十一味参芪片可以提高顺铂对斑马鱼模型的半致死浓度，改善巨噬细胞数量减少及恢复巨噬细胞吞噬功能，体现出良好的增效减毒作用，对斑马鱼血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）及Fms相关酪氨酸激酶1（Fms-related tyrosine kinase-1，FLT1）、激酶插入区受体样（kinase insert domain receptor，KDRL）的基因表达具有不同程度的抑制作用[50]。青蒿鳖甲汤能抑制斑马鱼肺癌细胞的增殖并促进细胞凋亡，在该研究中，青蒿鳖甲汤对H1299肿瘤生长的抑制率可达到39%，其作用机制可能与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路有关[51]。

3.2 结直肠癌

Pan等[52]分别将200个和100万个SW480细胞注入斑马鱼和小鼠体内建立结直肠癌模型，结果表明，经买麻藤醇提物处理5 d，可观察到斑马鱼体内红色肿瘤病灶的面积减小，且肿瘤细胞迁移距离明显缩短，而在28 d内裸鼠异种移植模型中也观察到肿瘤细胞减小的趋势，表明斑马鱼模型具有高通量、周期短、实验设置方便等优点，在体内研究中优于裸鼠模型，进一步揭示了斑马鱼模型在中药抗肿瘤药效评价中的适用性。败酱草水提取物可通过降低血管内皮生长因子受体FLT1、FLT4、KDRL、VEGFaa、VEGFc和酪氨酸激酶受体Tie1的mRNA表达，显著缩短斑马鱼胚胎肠下血管，并抑制HCT116细胞的迁移[53]。

一系列的研究表明，中药中广泛存在具有抑制肿瘤血管生成的天然植物活性成分。基于HCT116斑马鱼移植模型，Maradonna等[54]发现大麻素可下调细胞因子信号传送阻抑物3 mRNA，诱导白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和VEGF蛋白减少，通过调节IL-6/Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路，抑制肿瘤细胞增殖和血管生成。Silva等[55]发现一种来自白羽扇豆的蛋白低聚物（deflamin）可以抑制癌细胞的迁移和侵袭，并抑制胶原重塑和血管生成，显著控制癌症行为。Wang等[56]采用HT29结肠癌异种移植模型发现，肉桂酸乙酯能够抑制斑马鱼血管生成，进而抑制肿瘤转移。此外，丹参中的隐丹参酮[57]、铁皮石斛的多糖组分W-1可抑制斑马鱼体内肿瘤细胞的增殖，表现出一定的抗肿瘤活性[58]。

3.3 肝癌

莪术和三棱是一组以活血化瘀抗肿瘤的药对，在HepG2细胞移植模型中，Wei等[59]发现其水提物均可下调斑马鱼类固醇受体辅激活因子、肿瘤表皮生长因子受体、雌激素受体1、前列素内环氧化物合成酶和淀粉样前体蛋白的表达从而发挥抗癌细胞增殖、转移、血管生成和促进凋亡等抗肝癌活性，且两药联用抗肝癌活性增强。Xu等[60]研究表明，珍珠梅水提物通过调节VEGFR/细胞间质上皮转换因子凋亡通路，显著抑制肿瘤诱导的新生血管生成，有效促进斑马鱼HepG2细胞的凋亡。肉桂水提物通过抑制肿瘤血管的生成，阻断肿瘤生长发育所需的营养物质，从而抑制肿瘤的生长，并促进凋亡[61]。Ning等[62]评价了白花蛇舌草不同极性提取物的抗肿瘤活性，发现其醋酸乙酯部位对斑马鱼体内Hep3B细胞的抑制作用最为显著，为白花蛇舌草抗肝癌药效物质基础的研究提供依据。

重楼皂苷VII能够抑制斑马鱼血管生成，抑制癌细胞的侵袭、扩散和转移，并抑制癌细胞增殖[63-64]。Tian等[65]通过对斑马鱼新生和再生血管水平评估，发现冬凌草甲素可降低斑马鱼VEGFA及受体VEGFR2、VEGFR3的表达，抑制血管生成，并通过增加p53基因的表达，抑制肿瘤的生长和转移。Zhao等[66]研究表明，射干多糖80-2能显著抑制斑马鱼肿瘤的生长、转移和血管生成。和厚朴酚能够减少HepG2细胞在斑马鱼体内的外渗漏，抑制肿瘤细胞的转移，并促进细胞凋亡[67]。沙蟾毒精和1β-OH-沙蟾毒精均是蟾酥中的主要活性成分，被证实对肝癌斑马鱼具有治疗作用，研究表明，沙蟾毒精可调节脂质稳态，影响甘油磷脂代谢从而抑制癌细胞增殖和促进凋亡；1β-OH-沙蟾毒精可能是通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路诱导线粒体凋亡，从而促进癌细胞凋亡，发挥抗肝癌活性[68-69]。一些广泛存在于天然植物中的活性成分，如苦豆碱、没食子酸甲酯亦可通过不同途径实现对斑马鱼体内肝癌细胞的抑制作用[70-71]。

在中药复方研究方面，范琦琦等[72]利用肝癌LPC H12细胞移植斑马鱼模型，发现复方苦参注射液通过上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、Caspase-9和降低B淋巴细胞瘤-2、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等相关基因的表达，在一定程度上可抑制斑马鱼PI3K/Akt信号转导通路的激活，促进癌细胞凋亡，抑制肿瘤生长。

3.4 乳腺癌

转移是癌症患者发病率的主要因素，斑马鱼异种移植模型证实了肉桂皮提取物可抑制MDA-MB-231细胞的转移和扩散，其机制可能与糖酵解代谢有关[73]。地榆水提物可能通过缺氧诱导因子-1α/窖蛋白-1信号通路调节癌细胞自噬，并发挥抗转移的作用[74]。

抑制肿瘤血管生成是一种强有力的乳腺癌预防和干预方法，在斑马鱼异种移植模型中，观察到全缘金粟兰中的氯青霉素D可抑制斑马鱼血管生成，且显著抑制肿瘤的增殖和迁移[75]。Wang等[76]发现在含有麝香酮的栓塞附近，斑马鱼新生血管生成更少，其肿瘤细胞迁移距离更短。此外，大量研究表明，肿瘤干细胞参与肿瘤的发生和发展，靶向肿瘤干细胞可能是抗肿瘤的有效途径。五味子素M2可抑制斑马鱼体内乳腺癌干细胞的生长和增殖，进而抑制MDA-MB-231细胞的增殖[77]。补骨脂酚通过诱导乳腺癌干细胞凋亡，进而抑制斑马鱼体内乳腺癌细胞的转移[78]。在斑马鱼乳腺癌移植模型中，宝藿苷i可降低人乳腺管癌BT549细胞中转移相关蛋白（波形蛋白）和干细胞相关蛋白（乙醛脱氢酶1A1和β-连环蛋白）的表达，通过调节肿瘤相关巨噬细胞/C-X-C基序趋化因子配体1通路抑制癌细胞的转移[79]。Chen等[80]研究发现蛇床子素可显著降低斑马鱼热休克蛋白70、膜突蛋白和S100钙结合蛋白A的mRNA表达水平，通过下调重组整合素α3/β5信号传导抑制乳腺癌转移。

在中药复方研究方面，Guo等[81]采用中药方剂防己黄芪汤治疗乳腺癌斑马鱼，结果发现斑马鱼血管和淋巴管的生长受到抑制，并且可通过增加E-钙黏蛋白和减少乳腺癌上皮间质转化标记物（如扭曲螺旋转录因子1、E盒结合锌指蛋白2）的表达来抑制肿瘤细胞的生长和抗癌细胞转移，是肿瘤治疗的新靶点。癌毒清方在斑马鱼异种移植模型中抑制了乳腺癌的生长、自噬和转移[82]。乳移平抗乳腺癌作用可能与抗血管生成有关[83]。小金胶囊能诱导细胞凋亡，抑制斑马鱼MCF-7移植瘤生长和新生血管的形成，具有潜在的抗肿瘤作用[84]。基于斑马鱼异种移植模型，消痞方和紫杉醇联合使用可导致肿瘤组织细胞凋亡明显增加，显著增强紫杉醇对乳腺癌的化疗敏感性，可见消痞方是治疗乳腺癌的潜在辅助药物[85]。这些研究成果不仅丰富了中医治疗乳腺癌的手段，也为乳腺癌的综合治疗提供了新的思路和方法。

3.5 胃癌

Zhang等[86]采用斑马鱼体内生理性血管生成、肿瘤诱导血管生成实验，发现对香豆酸甲酯可以破坏斑马鱼胚胎节段间血管和肠下血管的生理形成，并通过抑制VEGF/VEGFR2和血管生成素/酪氨酸激酶信号通路，抑制肿瘤血管生成。熊果酸和齐墩果酸是猕猴桃根的主要抗肿瘤成分，可抑制斑马鱼体内HGC-27细胞增殖和转移，结合细胞实验推测其可能是通过调节细胞凋亡、铁死亡和和间充质细胞表型而成为一种有前景的抗肿瘤药物[87]。

综上，基于斑马鱼肿瘤模型所开展的中药抗肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌的研究中，涉及PI3K/Akt、JAK/STAT、mTOR等信号通路，通过促进癌细胞凋亡和自噬，抑制癌细胞增殖、迁移、血管生成等发挥中药的抗癌作用（图2）。基于斑马鱼可模拟人体发育机制及病理机制的优势，斑马鱼模型用于肿瘤机制研究具有广阔的前景。

4 结语与展望

近年来，研究者利用斑马鱼肿瘤模型，结合细胞模型或其他传统动物模型对中药提取物，中药单体和中药复方等进行了药效学评价，并阐释其主要活性机制，取得显著的研究成果，进一步证实了斑马鱼模型的可靠性，同时也揭示了中药在抗肿瘤方面的潜力。本文综述了黄连等11味中药提取物、朝藿定B等28个中药单体及青蒿鳖甲汤等8个中药复方基于斑马鱼模型在抗恶性肿瘤中的研究。其中中药复方的研究相对较少且不够深入，而斑马鱼的生理学优势及现代科技的发展，为今后中药复方的抗肿瘤研究提供强有力的工具，可以帮助研究者更好地阐明中药复方的物质基础和作用机制。

目前斑马鱼模型用于中药抗肿瘤的研究受到众多研究者的青睐，是验证传统功效、探索疾病机制、筛选新治疗靶点和潜在治疗药物的重要工具。但其同时也有一定的局限性：（1）斑马鱼个体小，解剖及组织定位具有一定难度，原位肿瘤植入难度较大。（2）大约70%的人类基因至少有1个明显的斑马鱼同源基因，但斑马鱼与人类蛋白质的差异仍不可避免地对药效产生影响[88]。（3）斑马鱼主要通过浸泡给药，因此对药物的水溶性有一定要求。（4）斑马鱼的生长环境与人类体内环境存在差异，其药物代谢途径与人也有一定差异，难以预测可能造成的影响[89]。当前，血管特异性基因转移的出现[90]、新型荧光生物成像探针及高分辨显微镜仪器和技术的不断发展，扩展了斑马鱼模型用于药物和疾病研究的能力，未来对斑马鱼肿瘤模型的应用将能突破其局限性，在模型研究、药物筛选、安全性评价等领域发挥更大作用。

来 源：梁沁沁，黎 欣，张冰月，夏中尚，张 帆，郝二伟，邓家刚，侯小涛．基于斑马鱼模型的中药抗肿瘤研究进展 [J]. 中草药, 2024, 55(24): 8644-8653.

来源：天津中草药一点号