Nat Neurosci：小鼠发育大脑最新图谱发布

摘要：2024年12月18日，美国弗吉尼亚大学Eli R. Zunder在Nature neuroscience杂志发表研究论文“A single-cell mass cytometry-based atlas of the developing mouse bra

2024年12月18日，美国弗吉尼亚大学Eli R. Zunder在Nature neuroscience杂志发表研究论文“A single-cell mass cytometry-based atlas of the developing mouse brain”，提出基于单细胞质谱流式细胞技术绘制的小鼠发育中大脑图谱。

哺乳动物大脑的发育需要不同细胞谱系间精确的分子变化。虽然发育中大脑的单细胞RNA丰度已通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行了表征，但单细胞蛋白质丰度尚未可知。为填补这一空白，作者对来自C57/BL6小鼠胚胎期第11.5天至第12.5天的全脑以及胚胎期第13.5天至出生后第4天的端脑、间脑、中脑和后脑进行了质谱流式细胞技术分析，从不同的细胞谱系中鉴定出了85个在分子层面有差异的细胞簇。分析证实了神经发生和神经胶质细胞发生的经典分子通路，通过免疫组织化学以及RNAscope验证后发现，质谱流式细胞技术与单细胞RNA测序在蛋白质和RNA表达方面存在差异，这表明了蛋白质水平测量对于识别功能性细胞状态的价值。

1. 通过质谱流式细胞技术对发育中小鼠大脑细胞进行分类

作者首先从C57/BL6小鼠胚胎（E11.5至E12.5为全脑，E13.5及以后为分区域样本）和新生幼崽（P4）中收集脑组织。采用机械和酶促方法将组织分解成单细胞悬液，并使用顺铂作为非渗透性活力染料标记活细胞。使用Maxpar X8 Antibody Labeling Kits将每种抗体与独特的稀土金属同位素结合。在CyTOF Helios质谱流式细胞仪上测定抗体的最佳染色浓度。细胞样本被冷冻保存并在分析前解冻并用钯条形码标记以确保均匀染色。预处理步骤包括珠子标准化、去条形码化、清理门控去除双倍体、聚集物、死细胞、碎片和其他金属污染物。批次校正以减少由于使用不同的抗体混合物导致的信号微小差异，最终获得了24,290,787个高质量的单细胞数据点。通过Leiden聚类算法对所有样本进行聚类分析，首先得到22个初始聚类，然后进一步细分为85个具有独特年龄分布、脑区分布和蛋白表达模式的簇。根据这些特性，确定了主要的细胞类别，包括神经干细胞（NSCs）、中间神经元祖细胞（INPs）、神经元祖细胞、潜在兴奋性神经元、抑制性神经元、放射状胶质细胞（RGCs）和胶质前体等。生物重复样本在UMAP图中的重叠显示布局未受任何单一样本明显影响，表明技术变异仅限于一小部分早期神经元细胞。

2. 通过免疫组织化学验证质谱流式细胞技术的蛋白质检测结果

为了评估单细胞分离过程中可能存在的系统性偏差，将FABP7、BCL11B、OLIG2和SOX2阳性细胞的相对丰度与免疫组化及共聚焦荧光显微镜的结果进行了比较。UMAP图叠加个体标记物表达情况以及代表性的IHC图像显示，不同细胞类型和年龄阶段的蛋白质表达差异显著。质谱流式细胞技术与IHC测量的阳性细胞比例总体上一致，两种方法测得的比例趋势几乎相同，但IHC略低可能是由于IHC仅反映了皮层组织切片背侧区域的数据，而质谱流式细胞技术涵盖了背侧和腹侧整个皮层区域。在E13.5时，质谱流式细胞技术测得的比例相对较低，因为IHC成像区域几乎包含了整个室管膜和副室管膜区，在这个年龄段富含SOX2表达细胞；这些验证结果证明质谱流式细胞技术能够准确地量化发育中小鼠神经系统中关键标记物的蛋白质表达，从而有效识别神经元、胶质细胞和其他非神经细胞。

3. 发育中小鼠大脑中蛋白质和mRNA表达模式的比较

将基于抗体的质谱流式细胞术测量结果，与年龄匹配（E11.5-E18.5）和组织匹配的scRNA-seq测量结果进行对比。手动匹配质谱流式细胞术和scRNA-seq识别的细胞簇，得到17种不同细胞类别。多数情况下，mRNA与蛋白质表达中各类细胞关键标记物的表达细胞百分比相符，但也有例外，如某些区域特定阶段的中间神经前体细胞的mRNA表达与蛋白质表达不符，部分NSCs、RGCs和神经胶质前体细胞的Slc1a3及早期少突胶质细胞的Sox10的mRNA与蛋白质表达不一致。许多标记物的最高mRNA表达水平往往先于或与最高蛋白质表达水平同时出现。