摘要：近年来，传统的（切除或切口）活检在癌症诊断和监测中的应用已经被液体活检所补充甚至取代。液体活检是通过采集体液并检测癌细胞或癌细胞释放的核酸来进行的。液体活检具有微创性，原则上允许直接且快速地提取肿瘤衍生信息。液体活检工作流程的一个关键部分是采样细胞的分子特征分

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近年来，传统的（切除或切口）活检在癌症诊断和监测中的应用已经被液体活检所补充甚至取代。液体活检是通过采集体液并检测癌细胞或癌细胞释放的核酸来进行的。液体活检具有微创性，原则上允许直接且快速地提取肿瘤衍生信息。液体活检工作流程的一个关键部分是采样细胞的分子特征分析，目的是识别能够检测或预测疾病状态的新型生物标志物。尽管已经开发出了许多方法（主要基于细胞表面表达），但它们在癌症诊断中的应用受到了癌细胞在标记表达上的异质性的限制。另外，众所周知，细胞是粘弹性实体，其物理和机械性能（如大小、形状和变形能力）会根据与不同生理和疾病过程相关的应力而变化。因此，细胞变形能力被提出作为一种无标签的生物标志物，以增强疾病诊断和临床决策。这对癌症尤其重要，因为癌细胞通常比非癌细胞更具变形能力，因此可以通过测量机械特性将癌细胞与其健康对应物区分开来。虽然细胞变形能力变化的根源尚未完全理解，但在单细胞水平上测量这些特性无疑会增强疾病诊断/预后能力。

为了解决这个问题，来自瑞士苏黎世联邦理工学院的Andew J. deMello等团队设计了一个超高通量的粘弹性微流控平台，能够以每秒高达100,000个细胞的速度（以及实时情况下每秒高达10,000个细胞）测量单个细胞的机械特性。为了展示所提出平台在临床场景中的实用性，本文对液体和固体肿瘤活检样本进行了单细胞表型分析，进行了细胞骨架药物分析，并在外周血样本中识别了恶性淋巴细胞。本文的粘弹性微流控方法为高通量、无标记的单细胞分析提供了机会，在临床诊断和个性化医学中有广泛的应用。相关工作以题为“Real-time viscoelastic deformability cytometry: High-throughput mechanical phenotyping of liquid and solid biopsies”的文章发表在2024年12月04日的期刊《Science Advances》。

1.创新型研究内容

图1A展示了粘弹性可变形性细胞仪的示意图。该微流控装置结构简单，具有三个主要功能。第一个是通过柱状阵列去除样品中的细胞聚集体，防止设备堵塞（R1）。第二个是将移动在平行微流控通道阵列中的细胞对齐并聚焦到中心线附近的狭窄流中（R2），第三个是使这些细胞在变形区通过时发生形变（R3）。在聚焦区，由于来自粘弹性载体流体的弹性力和惯性力的相互作用，沿着微流控通道流动的细胞在横向和纵向上被聚焦。在vDC装置中，细胞的聚焦发生在水平和垂直两个方向，实现了三维聚焦。聚焦性能的量化以前已经描述过，其中使用共焦显微镜测量微流控通道z轴不同位置处细胞的位置和分布。为了确认在3厘米长的方形横截面通道内发生了细胞聚焦，本文获取了Jurkat细胞（平均大小为11微米）和8微米珠子在入口下游几个距离处的图像。可以看到，从入口起2厘米处就已经发生了细胞聚焦。选择3厘米长的通道是基于观察，即通常在血液样本中发现的较小细胞比大细胞更慢地聚焦到通道中心，因此需要更长的通道长度。当聚焦后的细胞进入并通过狭窄通道阵列时，它们经历高应力，导致它们发生形变。聚焦区内的每个微通道长3厘米，具有50微米乘50微米的方形横截面。3厘米的长度足以确保有效的细胞聚焦。变形区内的每个通道宽15微米，深15微米，长300微米。在这样的狭窄通道中，悬浮细胞受到剪切和正应力的作用，因为与靠近通道壁的区域相比，流向通道中心的流速更高。这样的应力导致细胞发生形变，采取“子弹状”形状，如在变形区域拍摄的明场图像（图1B）和计算流体动力学（CFD）模拟预测的那样（图1C）。本文还进行了CFD模拟以分析流体性质和速度对壁面剪切应力（WSS）的影响。对于0.1% PEO，将压力从500增加到2000mbar，细胞上的平均WSS从1116.5增加到8799.14帕。对于更高的PEO浓度观察到类似趋势。例如，当使用0.1%至1.0% w/v范围内的PEO浓度时，对于500至2000mbar的压力，细胞经历的WSS从1116.5增加到15,347.5 Pa。因此，无论是实验条件如入口压力，还是流体的流变性质如聚合物浓度都显著影响细胞上的WSS，从而导致形变。

图1基于图像的粘弹性变形性细胞计数（vDC）

【血与乳腺癌细胞株的表型分析】

为了开始评估vDC的临床能力，本文首先检查了20倍稀释血液样本中包含的红细胞（RBCs）和外周血单核细胞（PBMCs）。样品以1bar的压力注入微流控装置。每种细胞类型的数据都分别采集，并在图2A中呈现，每个实验至少探测了5000个细胞。尽管这两个细胞亚群的平均大小相似，红细胞为35.4 ± 2.3 μm²，PBMCs为28.1 ± 4.9 μm²，但它们可以根据变形性的差异轻松区分开来（P

接下来，本文使用vDC对两种乳腺癌细胞系进行机械表型分析：BT474和MDA-MB468。BT474和MDA-MB468细胞都表现出上皮形态，其中BT474细胞是从固体、侵袭性导管乳腺癌中分离出来的，而MDA-MB468细胞则是从乳腺和乳房组织的胸腔积液中提取的。同样，这些细胞以1 bar的压力被注入，并通过变形微通道的通过过程被成像，以提取大小和变形性信息。与血细胞实验不同，这两种细胞系的变形性平均值几乎相同，MDA-MB468细胞为0.06 ± 0.02，BT474细胞为0.08 ± 0.02，现在的区分是通过评估细胞面积实现的，即MDA-MB468细胞为103 ± 16.5 μm²，BT474细胞为170 ± 22.4 μm²（P

图2 血液细胞和乳腺癌细胞的机械表型分析

【药理剂对细胞变形能力的影响】

接下来，本文使用vDC（粘弹性变形细胞仪）来研究各种药理剂对细胞物理和机械特性的影响。先前的研究已经证明了肌动蛋白和微管网络如何控制细胞的机械特性。肌动蛋白是一种结构蛋白，在细胞骨架中形成微丝。微管是长而刚性的由微管蛋白组成的圆柱形聚合物，它们抵抗收缩力并与其它细胞骨架聚合物相互作用以稳定细胞骨架。因此，本文评估了三种细胞骨架（干扰）药物对细胞变形能力的影响：Latrunculin B（Lat B）和细胞松弛素D（Cyto D），两者都是强效的肌动蛋白聚合抑制剂；诺考达唑（Noco）是一种抗有丝分裂剂，可逆地干扰微管聚合。在所有实验中，入口压力设置为500mbar，每次实验至少分析5000个细胞。最大密度的50%处的等高线便于实验间的比较。Lat B浓度在25纳摩尔和250纳摩尔之间变化，并与“固定细胞”和“无药物”对照测量进行比较。图3A显示了不同Lat B药物浓度、无药物和固定细胞的变形能力/细胞大小等高线图。通过比较等高线图，可以明显看出固定细胞与活细胞之间在变形能力上的显著差异。图3B和C报告了细胞变形能力和细胞面积的平均值。每种条件下的测量都进行了三次重复，vDC平台装载了含有四种不同药物浓度的样品。统计分析表明，暴露于高达125纳摩尔的Lat B浓度的样品与对照组相比，细胞变形能力没有显著变化。然而，暴露于250纳摩尔Lat B的样品显示出显著的变形能力值升高，正如方差分析（ANOVA）所确认的，P值为0.0003。考虑到细胞大小（面积），在药物处理条件之间没有观察到显著变化（P = 0.88到0.99）。同样，也进行了Cyto D浓度对肌动蛋白解聚影响的类似研究，图3D显示了不同Cyto D浓度、无药物（对照）和固定细胞的变形能力/细胞大小等高线图。类似的数据表明，与对照组相比，暴露于高达10微摩尔Cyto D浓度的样品在细胞变形能力上没有显著变化（图3E）。然而，对于20微摩尔的浓度，变形能力显著增强（P 0.033）。最后，活细胞和暴露于Noco的细胞相比于固定细胞显示出更高的变形能力值（图3G）。细胞暴露于高达10微摩尔的Noco浓度并没有导致平均变形能力的显著变化（图3H；P = 0.9903）。然而，暴露于100微摩尔Noco时变形能力值显著提高（P = 0.0033），细胞大小没有显著变化（图3I；P = 0.87到0.99）。这些数据证实了暴露于Noco后微管聚合减少。

图3 细胞骨架药物Lat B、Cyto D和Noco对细胞变形的影响

【血液中稀有细胞的定量分析】

作为检测血液中“罕见”LN229细胞的门控策略，本文首先在PBS缓冲液中模拟体内浓度（通过流式细胞术测量为3.5个细胞/μl）运行LN229细胞样本，并通过vDC设备。然后，从变形性与细胞大小的散点图中门控出LN229细胞群。随后，将全血稀释至107个细胞/ml，并以1:1000和1:10,000的比例加入LN229细胞（LN229: RBCs）。接着，本文进行了流式细胞术（FC）和vDC实验，以量化这些掺入比例下的LN229细胞数量。使用488 nm处的FSC-H信号评估细胞大小。LN229细胞的自发荧光发射在530 nm（FITC-H）处，使其能够与其他血细胞区分开来。非掺入血液样本（对照，图4A左）、含有1:1000比例（图4A中）和1:10,000比例（图4A右）的LN229:RBCs样本的二维密度图中提取出确切的LN229细胞数量。

掺入LN229细胞的血液样本被注入微流控平台并经受细胞变形。在标准操作条件下，处理1.1 ml十倍稀释血液样本大约需要1230秒，相当于每秒大约100,000个细胞的处理量。通过分析总共100,000个细胞，使用前述门控策略识别出LN229细胞（图4B中和右），而非掺入血液样本作为对照（图4B左）。鉴于LN229细胞的低丰度，本文还分析了200,000个细胞，以识别出显著的LN229细胞群。流式细胞术（蓝色条）和实时vDC（红色条）的数据在细胞浓度方面显示出密切的对应关系（图4C）。然而，在这种比较分析中，传统的流式细胞术实验是以30 μl/min的流量进行的（为了稳健操作所需），并且使用了1000倍的稀释因子（以防止芯片堵塞和并发事件检测）。值得注意的是，vDC能够使用80 μl/min的体积流速和10倍稀释因子量化每百万红细胞中多达100个CTCs的LN229细胞。为了展示使用高通量设备的优越性，使用20倍稀释的血液和15 μm x 15 μm的收缩微通道横截面进行了细胞变形性测量，结果表明：大约400,000个细胞的散点图由红细胞和白细胞亚群组成。

图4 使用传统流式细胞术（FC）和vDC进行稀有细胞定量

【对具有癌症干细胞特性的患者源性胶质瘤细胞与更分化的胶质瘤细胞进行表型分析】

胶质母细胞瘤是成人中最常见的也是最具侵袭性的原发性脑肿瘤。已经识别出不同的胶质母细胞瘤癌细胞亚群，从胶质瘤起始细胞（GICs）到分化的胶质瘤细胞。具有干细胞样特性的患者源性GIC细胞系（包括肿瘤启动潜能），在无血清条件下培养，并且与在含血清条件下培养的更长期分化的胶质瘤细胞系（LTCs）相比，对化疗和放疗更具抵抗力。准确识别GIC仍然是一个重要挑战，因为它们具有可塑性且缺乏选择性标记。在这方面，虽然某些表面标记或其组合已与癌症干细胞样特性相关联，但它们并非特异性针对癌症干细胞。因此，本文使用vDC来表征GIC和LTC的机械特性，并将它们与非恶性星形胶质细胞进行比较。如图5A所示，GIC细胞（具体为ZH-161、ZH-562、ZH-305、GS9和GS5干细胞）的平均大小显著小于LTC细胞（LN-428、LN-18、LN-229和T98G）的平均大小。此外，所有胶质瘤细胞均比初级人类星形胶质细胞（对照）小。尽管不同细胞系的变形能力相对异质（图5A中间），但大小和大小-变形能力比值都可以用来区分GIC（类干细胞）和LTC（分化）细胞（图5A左和右）。此外，平均细胞变形能力对细胞大小的核密度估计图揭示了三个报告GIC、LTC和初级星形胶质细胞群体的簇（图5B左）。每个细胞亚型的代表性明场图像如图5B右所示。最后，还应注意，来自两种肿瘤类型的细胞与其健康对照相比显示：平均细胞大小和大小-变形能力比值显著较低（图5C）。

图5 利用粘弹性变形性细胞计数研究胶质母细胞瘤干细胞和分化细胞的特征

【使用vDC对慢性淋巴细胞性白血病细胞进行机械表型分析】

开发无标签、经济高效且快速的诊断方法将改变血液恶性肿瘤的识别方式和治疗结果。值得注意的是，变形性细胞计数已经被用作无标签的恶性胸腔积液诊断，包括区分白血病和炎症过程。然而，迄今为止，没有研究展示使用机械表型分析来表征临床场景中的白血病细胞。为了填补这一空白，本文使用vDC测量并比较了来自健康血液样本和受白血病影响（人类）血液样本中分离出的CLL细胞和健康淋巴细胞的变形性。本文的目标是分类并机械表征从淋巴瘤患者获得的CLL细胞，并将其与健康个体的PBMCs和B细胞进行比较。图6A展示了恶性CLL细胞、健康PBMCs和健康B细胞的变形性与细胞大小的散点图，突显了大小和变形性信息在区分细胞类型方面的强大能力。对所有样本的完整分析揭示CLL细胞的平均细胞面积高于健康PBMCs（P

图6 利用粘弹性变形性细胞计数研究CLL的机械表型分析

2.总结与展望

本文已经开发并表征了一种能够在极高吞吐量下以无标记方式测量单细胞机械特性的变形性细胞仪。通过利用微流控限制和流体粘弹性，细胞在一个设备中被对齐和变形，而无需任何鞘流。为了评估vDC平台在临床场景中的实用性，本文对液体和固体肿瘤活检样本进行了细胞表型分析，分析了细胞骨架药物对细胞力学的影响，并表征了从外周血样本中分离出的恶性淋巴细胞的机械特性。更广泛地说，vDC有潜力改变血液疾病的临床评估，因为诊断信息是以超快且自动化的方式生成的。最后，由于细胞的物理特性（如变形性、形状和大小）是无标记的生物标志物，因此开发用于快速精确测量这些特性的工具无疑将在个性化医学中带来显著的进步。

来源：EngineeringForLife一点号