易基因： BS+ChIP-seq揭示DNA甲基化调控非编码RNA(VIM-AS1)抑制肿瘤侵袭性

摘要：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）早期复发仍然是一个具有挑战性的领域，其中涉及的机制尚未完全被理解。尽管微血管侵犯（Microvascular invasion，MVI）与HCC早期复发相关，但缺乏用于诊断和预后评估的理想生物

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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）早期复发仍然是一个具有挑战性的领域，其中涉及的机制尚未完全被理解。尽管微血管侵犯（Microvascular invasion，MVI）与HCC早期复发相关，但缺乏用于诊断和预后评估的理想生物标志物。DNA甲基化和长链非编码RNA（lncRNA）作为表观遗传调控因子，在HCC中的表达变化与疾病发病机制密切相关。因此，鉴定可以预测肝癌患者预后的DNA甲基化位点，并阐明驱动HCC侵袭性的分子机制至关重要。

近日，《Experimental & Molecular Medicine》期刊发表了题为“VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma“的研究论文，该研究探讨了在肝细胞癌（HCC）中，通过CpG甲基化调控的非编码RNA VIM-AS1（vimentin antisense RNA1）（一种1.8 kb长的非编码RNA）与IGF2BP1合作，通过EPHA3降解来抑制肿瘤侵袭性。研究发现，VIM-AS1高甲基化与HCC预后不良相关，并能够通过影响EPHA3 mRNA稳定性来调控HCC侵袭性。

标题：VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma（VIM-AS1 受 CpG 甲基化调控，与 IGF2BP1 协同作用，通过降解 EPHA3 抑制肝细胞癌中的肿瘤侵袭性）

期刊：Experimental & Molecular Medicine（Exp Mol Med）

影响因子：IF 9.5

技术平台：BS、ChIP-seq、MeRIP-seq分析、RNA-seq等（易基因金牌技术）

本研究首先利用CGRC和TCGA数据库中HCC患者样本的DNA甲基化数据，鉴定出HCC中的高甲基化CpG位点。数据分析结果揭示了cg02746869是VIM-AS1的关键调控位点。调控VIM-AS1表达的HCC细胞RNA-seq测序揭示了EPHA3是VIM-AS1的病理靶标，在HCC中发挥致癌作用。高甲基化导致的VIM-AS1表达抑制显著影响HCC细胞动态变化，尤其损害细胞的移动性和侵袭性。从机制上讲，VIM-AS1表达降低通过增强IGF2BP1与EPHA3 mRNA的结合来稳定EPHA3 mRNA，导致EPHA3 mRNA表达增加，并促进HCC进展。进一步体内实验证实，VIM-AS1-EPHA3轴调控HCC的肿瘤生长和肿瘤微环境。以上研究结果表明，cg02746869位点高甲基化导致的VIM-AS1下调通过m6A依赖性机制增加EPHA3 mRNA表达，从而增加HCC侵袭性。

结果图形

（1）cg02746869 甲基化状态调控 VIM-AS1 在 HCC 中的表达

图1：DNA甲基化分析揭示HCC患者VIM-AS1中cg02746869位点的高甲基化状态。

根据CGRC和TCGA数据库的甲基化组数据，示意图显示在HCC中鉴定出的50个高甲基化位点（左图）；50个高甲基化位点位于CpG islands、CpG shores、CpG shelves和open sea区域（中间图）；50个高甲基化位点与转录起始位点（TSS）之间的距离分布（右图）。在多种恶性肿瘤中cg02746869位点的beta值分析。热图表示不同类型癌症中VIM-AS1表达和cg02746869甲基化模式（左图）。cg02746869位点的beta值与VIM-AS1表达水平的相关性分析（右图）。在THLE2和HUH1中cg02746869位点的甲基化和相关VIM-AS1表达。在DNMT3A实验组中使用HRM和BS-seq验证甲基化水平增加，并检测到VIM-AS1表达下调。在TET1实验组中使用HRM和BS-seq验证甲基化水平下降，并验证了VIM-AS1表达。H3K27ac and H3K4me3的ChIP-seq基因组浏览器显示THLE2和HUH1中cg02746869位点活性标记富集结果。甲基化和去甲基化后cg02746869位点的ChIP-qPCR用于评估组蛋白活性和转录因子（TF）结合。Con =对照组，DNMT3A = 高甲基化cg02746869位点，TET1 = 低甲基化cg02746869位点。

（2）VIM-AS1过表达抑制癌细胞侵袭性

图2：VIM-AS1水平整体升高进而下调与细胞粘附相关的基因。

使用FISH检测VIM-AS1定位的代表性图像（左图）。VIM-AS1相对强度，表示亚细胞定位的百分比（中间图）。THLE2和HUH1之间每种亚细胞定位强度比较（右图）。通过qRT-PCR（左图）和RNA-seq（右图）验证VIM-AS1过表达细胞。在VIM-AS1过表达后上调和下调基因的差异表达基因（DEG）相关性分析图（左图）。红色=前5个上调基因；蓝色=前5个下调基因。VIM-AS1下调的DEG的GO分析（右图）。与细胞粘附相关下调DEG的GSEA结果。VIM-AS1过表达细胞中细胞粘附相关基因qRT-PCR。迁移和侵袭实验的代表性图像和定量分析。

（3）VIM-AS1 调控EPHA3 mRNA稳定性

图3：VIM-AS1调节EPHA3 mRNA稳定性，与HCC预后不良相关。

THLE2、HUH1以及甲基化修饰样本中EPHA3 mRNA相对表达量。显示EPHA3 mRNA表达量对VIM-AS1调控的响应变化。VIM-AS1 OE = VIM-AS1过表达，VIM-AS1 KD = VIM-AS1敲低。使用放线菌素D处理HUH1细胞后EPHA3 mRNA的RNA稳定性实验。VIM-AS1过表达后EPHA3蛋白的免疫印迹图。EPHA3 mRNA敲低后的细胞迁移和侵袭实验。使用GEPIA分析了不同阶段VIM-AS1和EPHA3 RNA的表达量。Kaplan-Meier生存曲线分析所有HCC患者以及微血管侵犯（MVI）患者EPHA3 mRNA预后生存率。

（4）EPHA3 mRNA 稳定性通过 IGF2BP1 与 m6A 位点结合来确定

图4：IGF2BP1以m6A依赖性方式破坏EPHA3 mRNA稳定性。

基因组浏览器快照显示GSE928399中HEK293T细胞EPHA3 MeRIP-seq的m6A修饰位点（顶部），使用RM2Target预测m6A位点（中间）以及实验靶向的3′UTR m6A位点区域（底部）。EPHA3的3′ UTR的MeRIP-qPCR结果。HCC肿瘤组织（T）相对于正常组织（N）中m6A修饰因子的差异表达；FC=倍数变化。RIP-qPCR实验显示HUH1细胞中与IGF2BP1结合的EPHA3和VIM-AS1 RNA。IGF2BP1沉默对EPHA3 mRNA表达的影响。对包括m6A位点在内的EPHA3 3′UTR野生型（WT）和突变型（MUT）构建体的MeRIP-qPCR分析。在IGF2BP1沉默后使用WT和MUT构建体进行的荧光素酶实验。

（5）VIM-AS1 干扰 IGF2BP1 与 EPHA3 结合

图5：VIM-AS1通过抑制IGF2BP1与EPHA3 mRNA的互作来调节EPHA3 mRNA表达。

a-b. RIP-qPCR实验显示，在HUH1细胞中VIM-AS1过表达（a）和在THLE2细胞中VIM-AS1敲低（b）后，VIM-AS1和EPHA3 mRNA对IGF2BP1的结合亲和力。

c. 示意图显示VIM-AS1表达增加/减少对EPHA3 mRNA的影响如何通过IGF2BP1介导。

d. FISH结果显示VIM-AS1和IGF2BP1（左图）以及EPHA3 mRNA和IGF2BP1（右图）定位。条形图显示每个FISH数据集相对共定位荧光强度。白色箭头=VIM-AS1或EPHA3 mRNA与IGF2BP1共定位区域。

（6）EPHA3 mRNA在与肝细胞癌（HCC）相关的成纤维细胞中富集。

图6：VIM-AS1-EPHA3轴调控基因参与HCC侵袭性。

在VIM-AS1过表达细胞和VIM-AS1与EPHA3共过表达细胞中VIM-AS1和EPHA3的相对表达量。GSEA显示与细胞粘附相关的基因。红色条形=因VIM-AS1过表达而表达量减少、但在VIM-AS1和EPHA3都过表达时增加的DEGs。基因网络分析揭示，由VIM-AS1调节的EPHA3 mRNA与EPHA3 mRNA表达量一同下调/上调。与EPHA3 mRNA协同调控基因的单细胞RNA-seq图谱（GSE149614）。

（7）VIM-AS1 过表达抑制 EPHA3 mRNA 并减少体内肿瘤发生

图7：VIM-AS1抑制肝细胞癌中肿瘤微环境的变化。

每组肿瘤体积和重量变化图表。从每组切除的肿瘤图像。细胞和结构变化的HE染色切片。胶原沉积的天狼星红染色。马松三色染色及胶原沉积面积的定量。α-SMA（顶部）和CD31（底部）的IF染色及定量。白色箭头= CD31阳性血管。Con=对照组，VIM-AS1 = VIM-AS1过表达，VIM-AS1/EPHA3 = VIM-AS1和EPHA3共过表达。

易小结

本研究通过BS-seq和ChIP-seq及对应的RNA-seq分析揭示了cg02746869是VIM-AS1的关键调控位点，其高甲基化与VIM-AS1的表达下调相关。VIM-AS1下调通过增强IGF2BP1与EPHA3 mRNA结合，增加EPHA3 mRNA表达，从而促进HCC进展。在HCC细胞中，VIM-AS1过表达能够降低与细胞粘附相关基因表达，并抑制HCC细胞的迁移和侵袭能力。在动物模型中，VIM-AS1过表达抑制了肿瘤生长和肿瘤微环境变化。

研究结果表明，VIM-AS1表达受CpG甲基化调控，其下调通过m6A依赖性机制增加了EPHA3 mRNA表达，从而增加HCC侵袭性。VIM-AS1和EPHA3可能作为HCC诊断和治疗的表观遗传标记。

本研究揭示了VIM-AS1通过表观遗传机制调控HCC侵袭性的新途径。确定了VIM-AS1和EPHA3在HCC进展中的重要作用，为HCC的治疗提供了新的靶点。并提供了基于表观遗传学的标志物，可能改善HCC的早期检测和预后评估。

易基因：DNA甲基化研究基本思路

DNA甲基化一般遵循四个步骤：

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。

其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。

再次，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。

最后，对筛选出的目标区域DNA甲基化进行验证，通常采用靶基因重亚硫酸盐测序（Target-BS）。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

全基因组甲基化图谱课题标志物筛选课题小规模研究课题

技术优势：

应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

技术类型

起始量

特点

覆盖度

常规WGBS

1μg gDNA

正常BS建库技术

95%

Micro DNA-WGBS

1-10000个细胞/1ng基因组DNA

在常规WGBS技术上进行技术改进，使得起始量大大降低，适合珍稀样本的研究

95%

scWGBS

单细胞/1-10个细胞

克服了组织内部细胞异质性的影响，可以满足单个细胞层面的课题研究

20%

Micro DNA-XRBS

1ng gDNA、单细胞

为Micro DNA-WGBS的简化版本，特别适用于大样本量的珍稀样本DNA甲基化研究

20M CG

关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。

DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。

应用方向：

ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位

转录因子和辅因子结合作用复制因子和 DNA 修复蛋白组蛋白修饰和变异组蛋白

技术优势：

物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。

技术路线：

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Han SH, Ko JY, Jung S, Oh S, Kim DY, Kang E, Kim MS, Chun KH, Yoo KH, Park JH. VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma. Exp Mol Med. 2024 Dec 2. pii: 10.1038/s12276-024-01352-6. doi: 10.1038/s12276-024-01352-6. PubMed PMID: 39617786.