新启示！中南大学范松青教授团队：克服非小细胞肺癌中奥希替尼耐药性的潜在治疗策略

摘要：12月25日，中南大学范松青教授研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了题为“Itraconazole Reversing Acquired Resistance to Osimertinib in NSCLC by Inhibiting t

【导读】迫切需要设计出有效的策略来应对对奥希替尼的耐药性发展。

12月25日，中南大学范松青教授研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了题为“Itraconazole Reversing Acquired Resistance to Osimertinib in NSCLC by Inhibiting the SHH/DUSP13B/p-STAT3 Axis”的研究论文，本研究表明伊曲康唑联合奥希替尼可协同降低奥希替尼耐药细胞的增殖和迁移能力，增强其凋亡能力，有效抑制奥希替尼耐药肿瘤的生长。尤其是，研究人员观察到SHH过表达通过SHH/DUSP13B/p-STAT3信号轴部分挽救了这种联合治疗策略的协同作用。此外，研究发现SHH、（GLI1）、p-STAT3和DUSP13B在奥希替尼耐药中具有重要的预测作用。在肺腺癌中，p-STAT3与SHH呈正相关，与DUSP13B呈负相关。综上所述，这些结果强调了伊曲康唑在逆转奥希替尼获得性耐药中的关键作用，并为奥希替尼联合伊曲康唑的治疗策略提供了科学依据。

背景信息

肺癌占癌症总发病率的11.4%，占全球癌症相关死亡的18.0%。低剂量CT筛查的广泛应用提高了肺癌的早期检出率，降低了死亡率。然而，大多数患者确诊时已发生远处转移，传统治疗模式的疗效仍不理想。在亚洲人群中，EGFR基因突变是肺癌最常见的驱动突变，突变率为30% ~ 50%。EGFR- tkis是特异性靶向EGFR基因突变的小分子药物。它们竞争性结合EGFR的ATP结合位点，抑制EGFR的自磷酸化，从而阻断信号转导，发挥抗肿瘤作用。在接受第一代和第二代EGFR-TKIs治疗后，大多数患者最终会出现T790M耐药突变。第三代EGFR-TKI奥希替尼（Osimertinib）可以克服这种耐药，显著延长EGFR突变肺癌患者的生存期。然而，接受奥希替尼治疗的患者最终会产生耐药。

导致奥希替尼耐药的机制主要分为两类：EGFR依赖和EGFR非依赖。EGFR非依赖机制主要涉及替代通路的激活和组织学转化。尽管对奥希替尼耐药的认识已经取得了一些进展，但由于其异质性和复杂性，仍远未完全阐明其完整的机制，也尚未找到克服奥希替尼耐药的解决方案。因此，需要更多的研究来探索奥希替尼获得性耐药的机制，并找到克服其的解决方案，最终改善肺癌患者的预后。

药物再利用是药物开发中的一项重要策略，因为它从现有的临床疗法中识别出可逆转奥希替尼耐药的药物，从而显著降低了药物研究的成本。初步筛选发现伊曲康唑对奥希替尼耐药细胞的增殖有抑制作用。伊曲康唑是临床应用广泛的抗真菌药物。近年来，多项研究表明伊曲康唑不仅具有抗真菌活性，而且对多种恶性肿瘤也有抑制作用。伊曲康唑通过多种途径发挥抗肿瘤作用。研究表明，伊曲康唑可通过AKT/mTOR/S6K、活性氧簇（ROS）、Wnt/β-catenin通路抑制肝癌细胞生长，促进细胞凋亡，从而发挥抗癌作用。虽然伊曲康唑具有强大的抗肿瘤作用，但其具体的分子机制尚不完全清楚。

伊曲康唑和奥希替尼联合用药诱导奥希替尼耐药细胞的自噬

研究人员探究了伊曲康唑联合奥希替尼对自噬的影响。研究人员观察到颗粒状 LC3 显著增加，表明联合治疗组中自噬体的数量增多。此外，LC3II/LC3I 的比率和 P62 也显著增加。mRFP-GFP-LC3 用于实时检测自噬流，其中 GFP（绿色）和 RFP（红色）分别标记在 LC3 上。在自噬溶酶体的酸性环境中，GFP 的绿色荧光被破坏，导致细胞内仅显示红色荧光，而自噬体则呈现黄色荧光。研究人员注意到联合治疗组中黄色点（自噬体）和红色点（自噬溶酶体）的数量显著增加，表明自噬流增加。透射电镜（TEM）显示，伊曲康唑联合奥希替尼显著增加了奥希替尼耐药细胞中自噬体的数量。

伊曲康唑与奥希替尼的联合使用可诱导奥希替尼耐药细胞发生自噬

为了明确自噬的具体作用，研究人员使用氯喹（CQ）通过抑制自噬溶酶体的融合和降解来抑制自噬。通过 CCK8 检测发现，与联合用药组相比，CQ 与伊曲康唑和奥希替尼联合使用进一步抑制了奥希替尼耐药细胞的生长。对细胞凋亡的分析表明，在使用 CQ 抑制自噬后，伊曲康唑与奥希替尼联合使用的协同促凋亡作用进一步增强。此外，结果表明，CQ 进一步增强了伊曲康唑与奥希替尼联合使用的协同抗迁移作用。研究人员进行了蛋白质印迹实验，发现抑制自噬后，伊曲康唑与奥希替尼联合使用对凋亡和迁移相关蛋白的调节作用进一步增强。出乎意料的是，研究人员发现抑制自噬后，p-STAT3 和 SHH 的水平进一步降低。

此外，研究人员下载了奥希替尼耐药数据集 GSE193258，并对获取的数据进行了基因集富集分析（GSEA）。该数据集包含了四个具有 EGFR 突变的细胞系（PC9、HCC827、H1975 和 HCC2935）在奥希替尼耐药前后的转录组测序结果。基因集富集分析显示，Hedgehog 信号通路在奥希替尼耐药的 HCC827 和 HCC2935 细胞中富集，JAK/STAT3 信号通路在奥希替尼耐药的 HCC827、H1975 和 PC-9 细胞中富集。

为了准确测定奥希替尼耐药性肺癌组织中 SHH/DUSP13B/p-STAT3 轴的表达水平，研究人员收集了 10 对奥希替尼耐药前后的临床肺癌组织标本，并进行了免疫组化染色。研究显示，SHH 蛋白主要在细胞膜和细胞质中表达，耐药后其蛋白表达水平高于耐药前。GLI1 和 p-STAT3 主要在细胞核和细胞质中表达，耐药后组织中的表达水平更高。此外，DUSP13B 蛋白主要在细胞质中表达，奥希替尼耐药后肺癌组织中的表达水平更低。

结论

总的来说，本研究极大地促进了对奥希替尼耐药分子机制的理解，并为克服非小细胞肺癌中这种耐药性的潜在治疗策略提供了启示。

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