结核分枝杆菌难分辨？这5种方法教你一眼识破“真凶”

摘要：我国结核病患病人数居世界第二位，全国感染率高达48%，每三个人中就有一个感染者，近年来新发病人增多，新耐药患者增多，早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键。结核病的实验室诊断主要包括结核杆菌的细菌学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断。

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一文全面分析

我国结核病患病人数居世界第二位，全国感染率高达48%，每三个人中就有一个感染者，近年来新发病人增多，新耐药患者增多，早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键。结核病的实验室诊断主要包括结核杆菌的细菌学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断。

下面为大家介绍结核病的实验室诊断技术。

痰涂片

在显微镜下找抗酸杆菌。它的优点是简单、快速，花费低，但其缺点是敏感性不够，每毫升痰中至少含5000-10000个细菌时才能得到阳性结果。但除了结核分枝杆菌以外，麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌也会被染成红色，所以即使抗酸染色结果是阳性，也不能确诊一定是结核分枝杆菌感染。

细菌培养

结核分枝杆菌生长周期较慢，需要培养2-8周才能出结果。结核分枝杆菌培养是结核病诊断的金标准。其灵敏性高于涂片，同时也为药物敏感性测定和菌型鉴定提供菌株。若要进行药敏试验，需在三级生物安全实验室进行操作。

血清学

通过采集血液检测，标本获取容易。2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果存在很高比例的假阳性和假阴性，该项目对结核病的诊断意义相对较小，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验。

γ-干扰素释放试验

γ-干扰素释放试验（IGRAS）：采用结核分枝杆菌特异性抗原刺激淋巴细胞，通过不同的方法来测量由致敏的血液淋巴细胞产生干扰素的数量。该方法诊断结核的敏感性较高，尤其是针对肺部以外的其他部位的结核感染，且不受卡介苗影响；诊断特异性方面较分子生物学方法差，不能区分既往感染。免疫系统缺陷或功能低下，可能出现假阴性结果。T-SPOT.TB和QFT是γ-干扰素释放试验的两种方法学的代表。1、T-SPOT.TB是用酶联免疫斑点技术，检测特异性抗原刺激下释放γ-干扰素的效应T细胞数量，以诊断结核感染。2、QFT采用酶联免疫吸附（ELISA）检测全血中致敏T细胞再次受到特异性抗原刺激后释放的γ-干扰素水平。上述两种检测方法的原理类似，检测技术和操作程序略有不同，均采用6kD早期分泌靶向抗原（ESAT-6）和10kD培养滤过蛋白肽段库（CFP-10）作为特异性抗原。

分子生物学

我国将分子生物学检测作为结核病病原学检查的手段之一写入了《WS 288—2017 肺结核诊断》中。通过实时荧光定量、恒温扩增、测序等分子生物学技术检测结核分枝杆菌核酸。结核病的分子检测的靶标主要有16SrRNA、16SrRNA和23SrRNA间的间隔区ITS、插入序列IS6110，以及hsp65、gryB和rpoB基因等，该方法诊断结核的灵敏度和特异度均较高，但灵敏度受标本质量影响。1、常规实时荧光定量PCR以MTB IS6110（特异性插入序列）为检测靶点，用于检测MTB或非结核分枝杆菌感染，在排除核酸污染的情况下可确定该检测标本中存在结核分枝杆菌，具有较高的敏感度和特异度。结核分枝杆菌核酸检测不能区分死菌或活菌，接受治疗或治愈的患者均有可能检测为阳性，因此目前的结核分枝杆菌核酸检测方法仅能用于结核病的诊断，不能用于临床疗效的监测。2、以Xpert为典型代表的荧光定量PCR技术，采用的GeneXpert检测平台，它将细菌裂解、核酸提取、扩增和检测整合起来，是一个于两小时内检测结核分枝杆菌及其对利福平耐药性的集成化分子诊断平台半巢式PCR扩增rpoB基因的192bp长度的结核分枝杆菌复合群的特异性序列，其中包含了81bp的利福平耐药决定区域（RRDR）序列。该区域用5个分子信标(探针A到E)进行探测，当5个探针中至少2个探针阳性才表明结核分枝杆菌检测阳性，如果RRDR存在突变，抑制了与一个或多个rpoB特异性分子信标的杂交，减少或消除了相应探针的信号，荧光信号会减弱或消失。3、交叉引物恒温扩增（crossing priming amplification，CPA）技术及实时荧光恒温扩增（simultaneous amplification and testing，SAT）技术，都是在恒定温度的情形采用特定的方法对靶标进行扩增，前者针对MTB复合群特异性的IS6110插入序列基因，后者针对16S RNA。SAT的优点在于以RNA为靶标，检测的阳性结果等同于结核分枝杆菌活菌的存在，优思达和仁度是两种技术的应用的公司代表。4、宏基因组高通量测序技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）通过对临床样本的DNA或RNA进行鸟枪法测序，可以同时检测多种病原微生物。mNGS虽然可涵盖绝大多数的微生物的检测，但是其需特殊的仪器，检测价格昂贵，对于基因文库的要求较高，且对于真菌和分枝杆菌等厚壁细菌需要破壁前处理，否则就会影响到这些细菌的检测阳性率。综上所述，除了培养出结核分枝杆菌外，其余实验室指标不能单独用来作为诊断或排除结核病的依据，需结合临床表现和影像学检查。为了提高结核病诊断的准确性，可联合二项或多项实验室指标进行检测。为了方便全国各地的检验人交流，我们特别成立了检验医学网全国交流群。欢迎您的加入，与大咖对话，分享经验和见解！