摘要：HBV感染是全球性的公共卫生问题，其慢性化进程可导致严重的肝脏疾病，包括慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。对CHB患者实现临床治愈的可能性进行精准预测，以及对临床治愈的定义有清晰和一致的认识，对于推动相关临床策略的实施以及新药研发具有重要作用
HBV感染是全球性的公共卫生问题，其慢性化进程可导致严重的肝脏疾病，包括慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。对CHB患者实现临床治愈的可能性进行精准预测，以及对临床治愈的定义有清晰和一致的认识，对于推动相关临床策略的实施以及新药研发具有重要作用。在第十一届华夏肝病论坛上，北京大学基础医学院鲁凤民教授对临床治愈定义演变的底层原因展开了详细的论述和深入的思考。本刊特将鲁教授演讲内容整理成文，供广大读者学习交流。同时，我们也荣幸地邀请到首都医科大学附属北京佑安医院郑素军教授分享了学习鲁凤民教授讲座后的心得体会，也欢迎广大读者针对CHB临床治愈这一话题展开深入探讨。
CHB的临床治愈（又称功能性治愈）是目前国内外指南公认的在部分患者可实现的治疗目标。随着科学研究及对疾病理解的不断深入，我国《慢性乙型肝炎指南》对临床治愈的定义也进行了持续更新[1-3]，从最初的血清学指标，到增加了共价闭合环状DNA（cccDNA）的相关标准。我国最新版指南指出，临床治愈为停止治疗后 HBsAg 持续阴性，伴或不伴抗-HBs 出现，HBV DNA 低于最低检测下限，肝脏生物化学指标正常，肝细胞核内可能仍存在cccDNA[3]。
国外相关指南对CHB临床治愈的定义也在不断演变[4-7]，最新版指南强调了经过有限疗程治疗血清HBsAg消失后，经24周的巩固治疗和治疗后≥24周的随访期内， HBsAg维持持续消失[7]。随着对疾病及治疗药物的不断深入研究和理解，人们发现cccDNA通过现有的治疗手段并不能被完全清除，而部分符合新的严格“治愈”定义的患者，其肝组织仍可以检测到cccDNA的存在，所以在CHB临床治愈定义历史演变的过程中，不再要求cccDNA清除。
国家药监局药审中心发布《慢性乙型肝炎病毒感染治疗药物临床试验技术指导原则》[8]，要求新药研发应立足临床治愈理解进行研究设计，停药期停止包括核苷（酸）类似物（NAs）的所有治疗药物，确证HBsAg消失需检测2次，间隔至少24周。
近年来，随着对HBV生物学特性的深入探索，HBV DNA整合到宿主基因组中的现象引起了广泛关注。这一现象不仅揭示了HBV致病的新机制，还对CHB临床治愈的定义有深远影响。
HBV在感染肝细胞内有两种存在，可转录表达全部病毒蛋白、支持病毒完整复制的cccDNA，和主要表达HBsAg的整合HBV DNA。HBsAg的表达不仅仅来源于cccDNA，也可以来源于整合HBV DNA，所以cccDNA的清除并不等于临床治愈。前面提到，实现临床治愈可能并不一定需要cccDNA的完全清除。由于整合的因素，也提示了我们清除cccDNA ≠ 临床治愈。
免疫组化的结果显示，代表cccDNA的core蛋白染色阳性（红色）细胞在不断减少，但肝内却很难看到HBsAg染色阳性（绿色）细胞的明显下降（图1），也证实了HBsAg的表达有不同的来源。长期的NAs治疗可使cccDNA 显著减少，但因对整合HBV DNA的作用有限，很少有血清HBsAg消失，整合的HBV DNA能够持续表达HBsAg，致使CHB更加难以治愈。
图1. 免疫组化结果
（源自讲者幻灯）
HBV感染在早期的组织学免疫耐受状态下，整合事件虽然也在发生，但并不重要。因为免疫耐受少有感染肝细胞被免疫清除，在这种状态下HBV感染的肝细胞并不会发生代偿性增殖。如果进入到炎症状态，反复的肝脏炎症导致肝细胞的死亡与残余肝细胞代偿性再生，进而导致克隆性扩增并形成能持续表达HBsAg的细胞集落，致使CHB难以治愈；同时，如果整合发生在了癌症基因周围激活癌基因，或者发生在抑癌基因的内部，抑制了抑癌基因的功能，那么在肝细胞代偿性增殖过程中，致癌基因突变的不断积累就会带来细胞的恶性转化，从而增加了HCC的发生风险。
既然HBsAg的表达有两方面来源，那么实现了临床治愈的患者，其肝组织内的cccDNA、整合HBV DNA是否被完全清除了呢？有文献表明[6]，在理想的功能性治愈（idealistic functional cure）及可现实的功能性治愈（realistic funcitonal cure）的情况下，cccDNA没有转录活性。所以，血清病毒学指标全阴定义的临床治愈，肝组织仍有cccDNA残留，但是我们对残留cccDNA是否有活性存疑。《中华肝脏病杂志》发表的文献中描述，在功能性治愈状态下，cccDNA的转录活性呈非活跃状态[9] 。但需要强调的是，非活跃状态并不代表没有转录。
cccDNA形成后发生超螺旋，形成串珠样核小体结构，以游离的微小染色体形式存在[10]。这一结构与宿主正常染色质存在着一定的相似性，如可被宿主蛋白表观异常修饰沉默，则就具有了逃避免疫系统攻击的潜力（图2）。因表观遗传学不同修饰的调节作用，以游离（episome）微小染色体存在的cccDNA存在转录活跃 / 转录沉默的不同状态[11]。沉默状态的cccDNA虽复制子代病毒的能力减弱，但却有了逃避宿主免疫的优势。
图2. cccDNA的不同转录活性状态
（源自讲者幻灯）
选择性剪接的调控是扩大真核生物蛋白质组多样性的最有效机制之一，有报道认为超过90%的人类基因的mRNA存在有转录剪接变异体。许多病毒在感染后劫持剪接机制来完成其复制周期。关于HBV，前基因组RNA（pgRNA）是病毒基因组复制的模板，已有许多报道描述了它存在不同的剪接变异体。HBV前基因组RNAs的选择性剪接能形成至少20个不同的剪接变异体。这些剪接形式可产生复制缺陷的颗粒，在感染患者的血液中可以检测到[12]。HBV选择性剪接的复杂调控可能参与了HBV相关肝病过程中的多个病毒和细胞过程，如pgRNA 最常见的转录后剪接变异体SP1不翻译P蛋白，逃避宿主免疫的清除。
血清HBsAg的清除标志着HBV感染的消退。然而，在基于聚乙二醇干扰素的治疗后达到临床治愈的患者中，超过五分之一可能在停药后发生HBsAg血清学逆转，导致HBV复发反弹的机制尚不清楚。研究表明[13]，临床治愈患者的cccDNA水平和HBsAg阳性肝细胞的占比显著低于未治愈和未接受治疗HBeAg阴性患者。与未治愈的CHB患者相比，获得临床治愈的患者整合HBV DNA和嵌合转录本水平虽然显著下降，但72.2%的患者肝内仍存在HBV RNA，25.5%的临床治愈患者甚至存在HBsAg阳性的肝细胞。肝内HBsAg阳性的临床治愈患者肝内HBV RNA、整合HBV DNA水平均高于肝内HBsAg检测阴性的临床治愈患者。临床治愈患者残留的肝内HBsAg主要来源于具有转录活性的整合HBV DNA；同时，cccDNA的微量转录活性也可以保持。
我们最近的一项研究表明[14]，与HBeAg阳性患者相比，HBeAg阴性患者血清HBsAg水平明显降低，但肝组织HBsAg蛋白水平无明显下降（图3）。慢性HBV感染患者肝组织RNA长读测序及整合HBV DNA模拟dslDNA质粒体外研究结果显示，HBeAg阴性患者较低的HBsAg分泌效率可能与整合HBV DNA来源的preS1 mRNA比例增加有关。后者导致L-HBsAg比例增加，HBsAg分泌受损。机制上，因整合的HBV DNA上的核心启动子被破坏，其增强子1 （EnhI）可以重新靶向preS1 （SP1）和preS2 （SP2）启动子，引起对SP1、SP2启动子的转录活性出现选择性差异，破坏转录活性平衡，从而导致L-HBsAg有超比例的表达。过渡增加的L-HBs导致了整合HBV DNA来源的HBsAg分泌受损。总之，整合HBV DNA独特的序列特征决定了整合HBV DNA来源的HBsAg分泌效率低于共价闭合环状DNA来源的HBsAg，并可能是部分“治愈”患者血清HBsAg低于检测下限、但肝组织内却有HBs蛋白检测阳性的原因。但我们认为，这可能是血清HBsAg低于检测下限后的一种过渡状态。随着宿主HBV特异性细胞免疫的进一步增强，肝组织内的HBs阳性细胞终将被清除。
图3. HBeAg阴性患者HBsAg分泌效率显著低于HBeAg阳性患者
综上所述，临床治愈状态下，体内的部分cccDNA 仍然具备转录活性。整合HBV DNA和cccDNA维持转录活性的现象提示我们，至少在部分患者，其“临床治愈”更像是处于一种强宿主免疫控制下的“动态清零”状态，即宿主免疫“监测和不断清除”肝组织内有cccDNA/整合HBV DNA转录表达的肝细胞。这意味着对于3/4的慢乙肝患者来讲，精准免疫远强于肝细胞内有转录活性的cccDNA和/或整合HBV DNA , 患者的血清病毒学指标均低于检测试剂的LLOQ。这也意味着此时仍需要维持一定时长的巩固治疗，并进行必要的病毒学反弹/复发监测，足够强大的HBV特异性免疫的建立是CHB理想的临床治愈所必需的，强效的直接抗病毒药物如能同时靶向cccDNA和整合HBV DNA转录本的小干扰RNA（siRNA）高效降低病毒负荷，再序贯/联合免疫调节，可能是未来最为有效的CHB治愈策略。
郑素军教授
CHB的临床治愈其实是一种血清学概念，即获得持续的血清HBsAg阴性，HBV DNA阴性、HBeAg阴性，并不要求完全清除肝内的cccDNA和整合的HBV DNA。这种状态的本质是宿主免疫足够强大，可有效监测、不断清除残存cccDNA和整合HBV DNA的肝细胞，并及时识别、清除肝细胞释放入血的HBsAg，使血清HBsAg维持在极低水平而呈检测阴性。
临床实践也证实了该观点的正确性。一方面，增加HBV特异性免疫可减少HBsAg 复阳、提高临床治愈率。目前基于干扰素治疗可使部分CHB患者获得血清HBsAg阴转，然而停药后10%-27.6%复发（血清HBsAg 复阳）。血清HBsAg阴转后，抗-HBs转阳及其水平的高低，常表明HBV特异性B淋巴细胞功能得以恢复并反映其程度。我们团队的前期研究显示：在聚乙二醇干扰素（Peg-IFN）治疗获取血清HBsAg阴转后，进一步联用乙肝疫苗可促进血清抗-HBs转阳并提升其水平；而血清抗-HBs＞100 IU/mL患者可减少患者复发。
另一方面，患者免疫力降低，则可能导致血清HBsAg复阳。在临床工作中，我们经常会碰到原本血清HBsAg阴性/抗-HBc 阳性患者，例如淋巴瘤等肿瘤患者，在接受免疫抑制治疗或化学治疗后，尤其应用B淋巴细胞单克隆抗体，使HBV DNA阴性者转为阳性，或HBsAg由阴性转为阳性，造成HBV再激活、甚至诱发肝衰竭。故我国《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》指出，对于HBsAg阴性、抗-HBc阳性患者，若使用B淋巴细胞单克隆抗体或进行造血干细胞移植，或伴进展期肝纤维化/肝硬化，建议应用 ETV、TDF 或 TAF 抗病毒治疗。
这一认识为未来CHB患者的HBsAg清除提供了重要治疗策略：在核苷（酸）类似物充分抑制HBV复制同时，通过siRNA/ASO技术降低HBV蛋白表达负荷，来解除大量表达的HBeAg、HBsAg对宿主免疫的抑制作用，进一步联合干扰素等免疫调节疗法、以增强HBV特异性免疫反应，有可能大幅提升CHB的临床治愈率。综上所述，该策略可简单归纳为：通过“祛邪扶正”（降低HBV负荷、增加宿主免疫），来达到“邪（残存cccDNA\HBVDAN整合）不压正（血清HBsAg阴性）”的结果。
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来源：健康乐盛会
