摘要：Q2.EMSA实验为什么检测不到信号或检测的信号低？A1） 使用的探针未标记；2）加入的标记探针量少，或者探针被降解；3）抗体效价低或者加入的抗体量过少；4）转膜失败；5）使用错误的膜进行转膜；6）曝光时间短；7） 交联不成功；8）实验过程中膜没有一直处于浸润

1）涡旋或加热破坏了DNA-蛋白复合物的结构；
2） 蛋白加入量较低或者蛋白降解。

1） 使用的探针未标记；2）加入的标记探针量少，或者探针被降解；3）抗体效价低或者加入的抗体量过少；4）转膜失败；5）使用错误的膜进行转膜；6）曝光时间短；7） 交联不成功；8）实验过程中膜没有一直处于浸润状态。

探针的长度应小于60bp，以有利于非结合探针和蛋白-探针复合物的电泳分离。如结合位点已初步被鉴定，则应用短的核酸探针（约为20bp），这样可避免其他位点的干扰。

可以通过启动子序列分析查找，确定探针设计范围，如果范围太宽泛，可以先将0.5-1kb片段克隆到荧光素酶报告载体验证其启动子活性以及是否受到该转录因子调控；寻找核心启动子可以通过分段截断验证。如果研究的转录因子具有已知的结合序列motif，则可以在该motif位点选择探针。也可以先进行ChIP或DNA pull down找到富集序列之后，再设计分段探针进行验证。

探针两端并非必须都要标记，但最好还是两端都进行标记，要优势如下：
提高灵敏度：两端标记可以增加探针与检测系统之间的相互作用位点，使检测信号更强，更容易被检测到，从而提高实验的灵敏度，能更准确地检测到蛋白质与核酸的结合情况。
减少空间位阻影响：在探针与蛋白质结合的过程中，如果标记只在单端，可能会因为标记物的存在产生空间位阻，影响蛋白质与探针的结合。两端标记可以使标记物分布更均匀，减少这种空间位阻对结合的影响，使实验结果更真实地反映蛋白质与核酸的相互作用。

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来源：金开瑞生物