摘要：今天推荐的是由贵州医科大学附属医院神经外科在2023年4月22日发表于Cell Death and Disease（2021IF：9.6963，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Liangzhao Chu教授，研究表明USP10对RUNX1进行去泛素化，促进胶

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今天推荐的是由贵州医科大学附属医院神经外科在2023年4月22日发表于Cell Death and Disease（2021IF：9.6963，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Liangzhao Chu教授，研究表明USP10对RUNX1进行去泛素化，促进胶质母细胞瘤的骨架-间质转化。

研究背景

胶质母细胞瘤（GBM）的间质（MES）亚型是一种高度侵袭性、恶性和增殖性的癌症，对化疗具有抗性。Runt相关转录因子1（RUNX1）被证明支持MESGBM，然而，其基本机制尚不清楚。

摘要部分

USP10的过量表达可上调RUNX1，并诱导骨髓到间质的转化（PMT），从而维持GBM的MES特性。此外，研究人员发现USP10抑制剂Spautin-1在体外和体内诱导RUNX1降解并抑制了MES特性。USP10维持GBM的MES特性，并促进GBM细胞的PMT。

研究内容

1.鉴定USP10为RUNX1的潜在DUB

RUNX1的泛素化驱动的蛋白水解是调节RUNX1稳定性和活性的一个核心PTM。研究人员构建并筛选了一个可以特异性沉默98个DUBs的siRNA库。结果显示，USP4、USP7、USP10和USP36与RUNX1的表达明显相关。然而，只观察到USP10和RUNX1之间的相互作用。接下来，研究人员构建了Flag标记的USP10-WT（野生型）和突变体USP10，并将其转染到HEK293T细胞。在HEK293T细胞中，异位表达USP10-WT，而不是USP10-C424A，会以剂量依赖的方式导致RUNX1蛋白的升高，强调了USP10通过其DUB活性稳定RUNX1表达的潜在作用。

研究结论：USP10对RUNX1进行去泛素化，RUNX1在GBM中高度表达，与MES特征正相关。

2.USP10在GBM中高表达，与MES特征正相关，RUNX1敲低抑制了USP10诱导的GBM的PMT

研究人员分析了58个四级GBM组织和10个正常组织中的USP10蛋白水平，发现GBM组织中USP10的表达量明显更高。为了探究USP10和RUNX1在GBM亚型中的联系，研究人员构建了不同GBM类型的GBM相关肿瘤标志物的表达热图。YKL-40（由CHI3L1基因编码的几丁质酶样糖蛋白）、MET（间质-上皮转化蛋白，一种酪氨酸激酶受体）、COL5A1（V型胶原蛋白α1）被选为MES亚型标志物，Olig2（少突胶质细胞转录因子2）、PDGFRα（血小板衍生的生长因子受体α）为PN亚型标志物。研究人员观察到USP10的表达与MES（RUNX1、YKL-40、MET和COL5A1）和PN（Olig2、PDGFRα）标记的正负相关。

在NBTs和MES、CL和PN亚型中的表达水平中，USP10在NBTs中的表达低于GBM组织中的表达，在GBM的三个亚型中，PN的表达最低，MES的表达最高。Western blot证实MES亚型样本的USP10蛋白水平更高。此外，与对照组LN229和GBM2细胞相比，USP10缺陷的细胞（使用小发夹干扰RNA敲低）表现出明显的RUNX1水平下降，这可以通过USP10-WT过表达有效恢复，但不能通过USP10-C424A恢复。研究人员使用U251和GBM1细胞评估USP10过表达是否影响PN和MES标记。在USP10上调后，MES标志物（YKL-40、MET和COL5A1）增加，而PN标志物Olig2和PDGFRα则减少。研究人员进行了transwell实验和CCK8，发现USP10的过表达极大地增强了U251和GBM1细胞的侵袭、迁移和增殖能力，而这种影响被RUNX1的敲低所抑制。接下来，研究人员评估了USP10在正位异体移植模型中的效果。生物发光图像显示，与用载体转导的异种移植相比，过表达USP10的U251和GBM1细胞的肿瘤体积有明显的差异，这些影响被RUNX1敲低所逆转。生存曲线进一步证实了这些发现，与相关的对照组相比，USP10高表达的异种移植物表现出明显的生存率下降，这种影响再次被RUNX1敲低所逆转。组织学上，H&E染色显示，USP10过量表达的异种移植物显示出急剧的肿瘤生长，而这种效果被RUNX1的抑制所逆转。此外，与对照组相比，MES标志物的表达明显上调，而PN标志物在USP10过表达的异种移植物中则下调，这种效应被RUNX1敲低所抵消。

研究结论：这些结果表明，USP10过量表达可能上调RUNX1，并在GBM细胞中诱导PMT，无论是在细胞系中还是在体内条件下。

3.RUNX1的过表达逆转了USP10敲低对GBM中PMT的抑制作用

在LN229和GBM2细胞中敲低USP10导致MES标志物（YKL-40、MET和COL5A1）的下调，而PN标志物Olig2和PDGFRα则增加。这些变化被RUNX1的过度表达所逆转。此外，对USP10的抑制明显损害了LN229和GBM2细胞的侵袭、迁移和增殖能力，这种影响也被RUNX1的过表达所逆转。与相关对照组相比，携带USP10缺失的LN229和GBM2细胞的小鼠的肿瘤形成延迟，这些变化被RUNX1过表达所逆转。Kaplan-Meier生存曲线显示，注射USP10缺失的LN229和GBM2细胞的小鼠比注射对照shRNA的小鼠寿命长得多，而RUNX1过表达后，颅内注射USP10耗尽的LN229和GBM2细胞的小鼠生存率明显下降。H&E染色的结果表明，携带USP10 shRNA的LN229和GBM2细胞的异种移植显示出限制性的肿瘤生长，而这种效果被RUNX1的过表达所逆转。此外，与对照组相比，USP10缺陷的肿瘤表现出MES标志物的表达明显减少，PN标志物的表达增强，而这些改变也被RUNX1的过表达所逆转。

研究结论：USP10的缺失可能抑制RUNX1并损害GBM细胞的PMT。

4.USP10与RUNX1的相互作用

研究人员进行了免疫共沉淀（Co-IP），观察到RUNX1与USP10-WT或USP10-C424A的相互作用。接下来，GST下拉试验表明，GST-RUNX1可以直接与USP10-WT或USP10-C424A结合，而不是单独与GST结合，表明USP10的DUB活性不需要与RUNX1相互作用。免疫荧光染色显示，USP10与RUNX1在LN229和GBM2细胞的细胞核内有广泛的共定位。此外，在这两个细胞系中，USP10和RUNX1之间的直接物理相互作用也被确认为内源性的。为了进一步评估USP10和RUNX1的哪些结构域介导这种相互作用，研究人员对USP10中可能与RUNX1相互作用相关的区域进行了突变。研究人员发现，USP10与RUNX1的相互作用是由USP10的（1-206）N端片段控制的。此外，研究人员的结果还表明，RUNX1的N端序列包含一个Runt结构域（1-204个氨基酸），是与USP10直接互动所必需的。

研究结论：位于N端的USP10的调节域是其与RUNX1结合的必要条件，因为在删除这个调节域后，没有观察到相互作用。

5.USP10通过去泛素化稳定RUNX1

与对照组细胞相比，研究人员没有观察到USP10沉默的LN229和GBM2细胞中RUNX1mRNA表达的变化。这表明，USP10可能在翻译后水平上调节RUNX1。此外，这些USP10缺陷的细胞表现出RUNX1表达的减少，通过添加蛋白酶体抑制剂MG132可以恢复。接下来，蛋白合成抑制剂环己酮被用来确认USP10对控制和USP10缺陷的LN229/GBM2细胞中RUNX1稳定性的调节作用。研究人员观察到，RUNX1的降解与USP10表达的减少呈正相关。强制表达USP10-WT，而不是USP10-C424A，导致U251和GBM1细胞中异位表达的RUNX1蛋白稳定性明显增加。接下来，RUNX1的泛素化水平被确定。研究人员使用两个不重叠的慢病毒shRNAs敲低了LN229和GBM2细胞中的USP10。研究人员注意到，与对照组细胞相比，被USP10沉默的RUNX1的泛素化水平明显升高。此外，研究人员观察到在USP10过量表达的U251和GBM1细胞中，RUNX1的泛素化明显减少，但在过量表达突变体C424A-USP10的细胞中则没有。

研究人员在无细胞条件下将聚泛素化的RUNX1与纯化的GST-USP10 WT或GST-USP10 C424A孵化。在体外将多泛素化的RUNX1与GST-USP10 WT孵化，但不影响GST-USP10 C424A（它仍然能够与RUNX1相互作用），RUNX1的去泛素化受到影响，这表明USP10直接从RUNX1中去除泛素。以前的研究表明，底物蛋白的Lys48和Lys63连接的泛素化可以分别通过蛋白酶体和内体-溶酶体依赖的途径介导蛋白质降解。研究人员的观察表明，USP10通过去除与Lys48相连的泛素而不是Lys63来对RUNX1产生影响。此外，研究人员在USP10抑制的LN229和GBM2细胞中表达了一种抗Lys48的（Lys48R）形式的泛素，发现强制表达Lys48R泛素会减少USP10抑制诱导的RUNX1下调。

研究结论：总之，这些数据提供了强有力的证据，证明USP10通过去泛素化稳定RUNX1。

6.小分子抑制剂对USP10的抑制导致RUNX1的降解并抑制PMT

研究人员使用选择性的USP10小分子抑制剂Spautin-1来研究USP10-RUNX1轴。发现Spautin-1抑制了USP10和RUNX1蛋白的表达，但不影响mRNA水平。这种对RUNX1的抑制作用被使用MG132对蛋白酶体的抑制所逆转。事实上，Spautin-1和CHX的联合处理可以显著减少RUNX1蛋白的半衰期，使其少于2小时。Spautin-1对RUNX1蛋白泛素化降解的影响与LN229和GBM2细胞中的USP10敲低类似。Spautin-1几乎完全抑制了USP10在U251和GBM1细胞中去泛素化RUNX1的能力，而该抑制剂降低了RUNX1和MES亚型标记的表达，增加了GBM细胞中PN亚型标记的表达。这些影响被RUNX1的过度表达所逆转。此外，Spautin-1抑制了LN229和GBM2细胞的侵袭、迁移和增殖，这也被RUNX1的过表达所废除。

研究人员用20mg/kg Spautin-1治疗携带来自荧光素表达的LN229和GBM2细胞的颅内肿瘤的小鼠。与车辆处理的小鼠相比，接受Spautin-1的肿瘤小鼠显示出对肿瘤形成和生长速度的抑制，这被RUNX1过表达所逆转。Kaplan-Meier生存曲线显示，用Spautin-1治疗的小鼠与用药物治疗的小鼠相比寿命明显更长，而RUNX1过表达则逆转了生存率的提高。H&E染色显示，Spautin-1抑制了颅内肿瘤的形成，这一效果也被RUNX1过表达所逆转。免疫组化分析显示，Spautin-1减弱了裸鼠异种移植肿瘤中USP10、RUNX1和MES标志物的表达水平，增强了PN标志物的表达。

研究结论：小分子抑制剂Spautin-1对USP10的抑制可能促进RUNX1的降解以抑制PMT，从而抑制GBM的进展。

7.GBM中USP10/RUNX1轴的临床意义

研究人员在原发性GBM标本（PN亚型）和相应的复发性GBM标本（MES亚型）中测量了USP10和RUNX1的表达。与原发性PN肿瘤相比，MES肿瘤的USP10和RUNX1水平明显升高。同时，与原发性PN肿瘤相比，复发性MESGBM组织中的USP10和RUNX1蛋白水平也急剧上升。共有58个GBM标本通过免疫染色进行了分析。研究人员观察到USP10和RUNX1的表达有明显的正相关关系。事实上，USP10高表达的患者（n=29）与USP10低表达的患者（n=29）相比，其无病生存率和总比率更差。

研究结论：USP10可以明显诱导RUNX1的激活，USP10/RUNX1分子轴通过促进GBM的PMT而明显影响GBM的临床结果。

结论与讨论

泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解控制着细胞中RUNX1的稳定性。研究人员发现，USP10调节RUNX1的蛋白水平，但对其mRNA水平没有影响。这些结果表明，RUNX1的蛋白水平受到USP10的调节，这种调节是通过翻译后的修饰而不是通过基因转录发生的。USP10不会激活RUNX1的基因表达以促进RUNX1蛋白水平的提高；相反，USP10很可能对RUNX1进行去泛素化，抑制RUNX1被26S蛋白体降解，从而维持细胞中的RUNX1蛋白水平。

此外，研究人员发现USP10通过USP10的N端1-206片段和含有RUNX1的Runt结构域（1-204氨基酸）的N端序列与RUNX1相互作用。Lys48-和Lys63-连接链是多泛素链的两种主要形式，与蛋白酶体途径介导的蛋白质降解相关。事实上，USP10能显著降解RUNX1的lys48-聚泛素链，但对lys63-聚泛素链没有影响。这些结果表明，USP10通过泛素蛋白体途径控制RUNX1蛋白的降解，而不依赖于内体-溶酶体途径。此外，表达高水平USP10的GBM患者表现出较差的总生存率和无病生存率，而GBM组织样本证实了USP10和RUNX1之间的明显相关性。总之，研究人员的数据表明，USP10/RUNX1轴可能对GBM患者的预后有预测价值。

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全文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-023-05734-y

来源：科技公式