摘要：在小麦的“绿色革命”中，Rht-B1b和Rht-D1b等位基因通过干扰赤霉素(GA)信号途径实现了矮杆化。然而，这些矮化基因在带来诸多优势的同时，也伴随着一些负面效应，如小麦地上生物量下降、胚芽鞘缩短等问题。因此，为了克服这些不利影响，寻找新的赤霉素敏感型矮化
在小麦的“绿色革命”中，Rht-B1b和Rht-D1b等位基因通过干扰赤霉素(GA)信号途径实现了矮杆化。然而，这些矮化基因在带来诸多优势的同时，也伴随着一些负面效应，如小麦地上生物量下降、胚芽鞘缩短等问题。因此，为了克服这些不利影响，寻找新的赤霉素敏感型矮化基因成为了研究的重点。近期的研究“Manipulation of the microRNA172–AP2L2 interaction provides precise control of wheat and triticale plant height”通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，靶向miR172结合位点，成功在小麦品种Kronos和小麦黑麦杂交种UC-Bopak中诱导了AP2L-B2基因突变。研究团队采用了不同的突变组合，并通过田间试验和温室实验等手段，系统评估了株高、穗部发育和抗倒伏性等性状。结果表明，AP2L2基因中miR172靶位点的不同突变可以精确调控小麦及小黑麦的株高。
这一研究不仅为小麦品种的株高控制提供了更加精准的选择，同时也为小黑麦的育种提供了新的思路和技术支持。该技术具有显著的实际应用价值，能够快速实现目标性状的改良，为小麦的高效育种提供了重要的工具。
禾本科植物的株高受一个复杂的遗传调控网络控制，其中保守的microRNA172(miR172)与APETALA2-like(AP2L)组成的调控模块扮演着核心角色。研究表明，miR172通过精确调控AP2L基因的表达，来影响小麦的株高、开花进程及穗部发育。当使用MIM172技术抑制miR172的活性时，小麦的生殖转变过程会延迟，株高降低，穗部发育趋于紧凑。AP2L基因中miR172靶位点的点突变能够降低miR172的活性，产生抗性等位基因rAp2l，这种突变对小麦的株高和穗部特征有显著影响。尤为关键的是，源自驯化基因Q的rAp2l-A5等位基因，在Q基因或其同源基因AP2L-D5中的miR172靶位点发生进一步突变时，虽然能导致株高降低，但也会引发穗部发育缺陷。基于此，作者提出了以下的科学问题。
科学问题：如何利用化学诱导和CRISPR技术优化rAp2l等位基因，以在调控株高和穗部发育之间找到平衡点，从而实现小麦品种的高效改良。
本研究中，作者探讨了化学诱导的四倍体rAp2l-A2等位基因和六倍体rAp2l-B2等位基因以及多种新的CRISPR诱导的等位基因的影响。
附图S1降低miR172的活性导致小麦植株降低
(a)调节miR172与AP2L2相互作用的不同方法(MIM172、CRISPR、EMS)；(b)野生型、rAp2l-A2、rAp2l-B2以及双突组合的小麦植株抽穗后三周表型；(c)小麦茎长差异
主要研究结果：
1、利用CRISPR-Cas9技术探究rAp2l-B2等位基因对小麦株高的影响
作者在半矮秆品种Kronos中发现，rAp2l-A2等位基因经过EMS诱变后，茎长减少了21%。然而，当将rAp2l-B2等位基因导入Kronos或其rAp2l-A2突变体中时，茎长减少幅度达到了43-45%。为了消除AP2L-A2中的多态性对gRNA功能的潜在干扰，作者巧妙地运用了CRISPR-Cas9技术，并专门设计了靶向AP2L-B2基因中miR172识别位点的特异性gRNA。在携带Rht-B1b等位基因的Kronos和一个含有Rht-B1a等位基因的高秆近等基因系中，作者成功诱导了多个CRISPR T0转基因事件。这些事件中的大多数突变体表现为在miR172靶位点处发生了微小的移码插入或缺失，且这些突变精确地发生在保守的AP2结构域下游并紧邻终止密码子。值得注意的是，这些突变无论是框内突变还是移码突变，都产生了半显性的矮化效应，这表明基因末端阅读框的轻微破坏对AP2L2功能的影响相对有限。图1a-g :(a)AP2L2基因编辑的示意图；(b)KronosRht-B1a、Rht-B1b以及T2代rAp2l-B2基因编辑植株抽穗后3周表型；(c)茎长；(d)小穗密度；(e)抽穗天数；(g)14天幼苗的第一片叶叶长
在高秆的Rht-B1a植株和半矮秆的Rht-B1b背景下，矮化的rAp2l-B2等位基因均展现出相似的显性效应。在两种遗传背景的T2代中，不同突变的纯合子均显著影响株高，且影响程度随突变类型而异。特别是在Rht-B1a背景下，最强的rAp2L-B2等位基因能将株高降低至与Rht-B1b相似的水平，暗示其作为Rht-B1b替代基因的潜力。此外，rAp2l-B2植株还表现出穗长减少和每穗小穗数量略有增加的特点，从而提高了小穗密度。在Rht-B1a背景下，转基因系的抽穗期延迟了1.8至2.9天，这与Rht-B1b导致的延迟程度相当；而在Rht-B1b的对照系中，抽穗期延迟更为显著（4.4天）。尽管这些等位基因对植株高度或抽穗时间的影响较为有限，但它们在胚芽鞘长度方面却展现出优于Rht-B1b等位基因的表现。
2、利用CRISPR基因编辑技术降低小黑麦株高、增强抗倒伏能力
高效的CRISPR载体使得小麦在保持优良遗传背景的同时，能够快速诱导产生不同的rAp2l2矮化等位基因，从而避免了耗时的杂交过程。为了验证这一策略的有效性，作者成功培育了小黑麦品种UC-Bopak(PVP 202100269)的半矮化突变体。小黑麦作为一种人为创造的异源六倍体(AABBRR)，通常具有植株高大、穗大且重的特征，这增加了倒伏的风险。作者利用相同的gRNA对UC-Bopak进行了遗传转化，该gRNA靶向AP2L-B2和AP2L-R2同源基因中的miR172结合位点。在温室条件下，编辑后的植株株高显著降低，且双突植株的降低幅度更大。对于AP2L-R2突变植株以及AP2L-B2和AP2L-R2均突变的植株，其株高与突变对miR172结合能力预测的影响呈现出高度相关性(R值分别为-0.94和-0.73)。对小黑麦和小麦的结果进行综合分析进一步显示，这种相关性具有高度的显著性(P=0.0014)。通过选择不同组合的rAp2l2突变，作者能够精确调控小黑麦的株高，同时确保胚芽鞘和第一片叶的长度以及抽穗时间不受影响。此外，编辑后的植株穗部结构更为紧凑，但小穗数量保持不变。
图1h-n : (h) 小黑麦品种UC-Bopak中利用CRISPR-Cas9技术生成的rAp2l-B2和rAp2l-R2等位基因;(i) 野生型小黑麦和rAp2l2基因编辑株系在抽穗后3周的表型；(j) 发芽后10天的幼苗；(k)田间试验；(l)植株高度；(m)倒伏情况；(n)籽粒产量
后续研究中，作者对AP2L-B2(B)或AP2L-R2(R)中miR172靶位点发生1-bp缺失的植株连续两年进行了田间性状评估。2023年，以头行为实验单位，发现编辑植株矮化了17–18厘米；2024年，则采用小区产量试验为实验单位，编辑植株矮化幅度为12–14厘米，这表明可能存在一定的环境互作。尽管编辑植株的穗部更为紧凑，但籽粒产量与野生型相比无显著差异。然而，在第二年，野生型试验区倒伏情况著多于编辑植株(P
图S5 2023年田间试验：比较小黑麦品种UC-Bopak与在AP2L-B2(小麦B基因组)或AP2L-R2(黑麦R基因组)的miR172结合位点具有1个碱基缺失的CRISPR系
(a) UC-Bopak与携带AP2L-R2中1个碱基缺失的CRISPR编辑系进行比较；(b)茎长；(c)小穗密度；(d)每行籽粒产量
3、总结与讨论
综上所述，该研究证实了对AP2L2基因中miR172靶位点的不同诱导突变能够作为一种精确调控小麦和小黑麦株高的有效手段。与目前广泛使用的赤霉素不敏感的Rht1b等位基因相比，rAp2l2等位基因可以作为一个替代基因实现株高的精确调控，这对于提高作物的抗逆性、稳定性以及最终产量具有重要意义。
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来源：青岛赶集小哥