摘要：DNAse I 作为一种功能多样且极为重要的酶，发挥着不可替代的作用。它能够非特异性地对 DNA 进行切割，最终生成 5' 端带有磷酸基团的二核苷酸、三核苷酸，或者寡核苷酸片段。凭借这一特性，DNase I 成为了强大的 DNA 操作研究工具，广泛应用于诸多分

DNAse I 作为一种功能多样且极为重要的酶，发挥着不可替代的作用。它能够非特异性地对 DNA 进行切割，最终生成 5' 端带有磷酸基团的二核苷酸、三核苷酸，或者寡核苷酸片段。凭借这一特性，DNase I 成为了强大的 DNA 操作研究工具，广泛应用于诸多分子生物学实验流程之中

一、DNase I 单位的精准界定

DNase I 的比活性是衡量其降解双链 DNA 能力的关键指标。在过去，其比活性多采用库尼茨单位（Kunitz）来表示。一个库尼茨单位的定义为：以鲑鱼精子 DNA 作为底物，在 0.1M NaOAc（pH 5.0）缓冲液的特定条件下，能够使反应液每分钟的吸光度增加 0.001 所需要的酶量。但值得注意的是，这种用于定义库尼茨单位的缓冲液条件，与实际实验中 DNase I 消化 DNA 时所使用的典型缓冲液条件存在差异。如今，新的活性测定程序借助实时荧光分析法，能够实现对 DNase I 活性更为快速且定量的测量，为 DNase I 活性评估提供了更精准的方式，进而给出了在标准条件下更能反映其降解 DNA 能力的单位定义。

二、影响 DNase I 活性的关键因素

1.金属离子的作用

DNase I 在仅含有 Mg2 + 却不含 Ca2 + 的缓冲液环境中，实际上并不具备活性。有研究文献表明，在看似不含 Ca2 + 的缓冲液中若检测到 DNase I 存在少量活性，极有可能是由于钙离子污染所引发的协同激活作用。Ca2 + 能够与 DNase I 紧密结合，进而稳定其活性结构。即便是处于微摩尔水平的 Ca2+，在 Mg2 + 同时存在的情况下，也能够有效地激活 DNase I 的活性反应。若在缓冲液中加入远低于 Mg2 + 浓度，但高于 Ca2 + 浓度的 EGTA，能够有效抑制 DNase I 活性，抑制程度可达 1000 倍甚至更高。

2.缓冲液离子强度的影响

缓冲液的离子强度同样是影响 DNase I 活性的重要因素之一。当缓冲液中仅含有 Mg2 + 与 Ca2+，且不存在其他盐类时，DNase I 能够展现出最高的活性。一旦标准反应缓冲液中加入的盐（如 NaCl 或 KCl）浓度从 0 逐渐增加至 30mM，DNase I 的活性将会降低超过 2 倍。虽然在某些转录缓冲液中也含有一定量的盐，但由于其中所含的 DNase I 量远远超过降解 DNA 模板所需的量，因此依然能够取得较好的 DNA 降解效果。

三、DNase I 剪切作用的特异性剖析

当 DNase I 对非匀质的双链 DNA（dsDNA）进行消化时，其产物主要为 60% 的双核苷酸、25% 的三核苷酸以及少量的寡核苷酸。DNase I 能够作用的最小片段为三个核苷酸组成的片段。尽管通常认为 DNase I 切割 DNA 的过程不具有特异性，但深入研究发现，它实际上对某些序列片段存在偏好。

例如，相较于其他区域，DNase I 更容易作用于 DNA 的小沟区，并且在嘌呤 - 嘧啶序列处进行剪切的倾向更为明显。不过，在面对非匀质 dsDNA 时，DNase I 会对四种碱基都进行剪切，且对任何一种特定碱基的作用程度相较于其他碱基，不会超出 3 倍以上。此外，DNase I 虽然能够对单链 DNA（ssDNA）以及 RNA - DNA 杂交链中的 DNA 进行剪切，但其活性相较于切割 dsDNA 时大大降低。例如，其剪切 ssDNA 的比活性仅约为剪切 dsDNA 比活性的五百分之一，在 RNA - DNA 杂合链中的活性小于作用于 dsDNA 时活性的 1 - 2% 。但由于实验中往往使用远高于实际需求浓度的 DNase I，所以在特定检测条件下，其对 ssDNA 和 RNA - DNA 杂合链的切割程度会有所不同。

四、在 RNA 制备中去除 DNA 污染的应用及要点

1.DNA 污染来源及处理需求

在 RNA 制备过程中，使用 DNase I 降解残留的 DNA，从而将基因组 DNA 的含量控制在较低水平（低于 10µg/ml），对于避免其对后续的 RT - PCR 实验产生干扰至关重要。一次 DNase I 反应能够处理的 RNA 量，与样品中 DNA 污染的程度密切相关。在进行有机萃取，或者采用固相 RNA 纯化方法时，如果二氧化硅基体过载，均有可能引入 DNA 污染。另外，从某些特定组织（如脾、肾、胸腺）以及转染后的细胞中提取的 RNA，通常也更容易存在较高水平的 DNA 污染。有研究报告指出，采用 Chomcynsk 和 Sacchi 方法从肿瘤组织中提取 RNA 时，所提取的 RNA 中可能含有 7% 的 DNA，若 RNA 制备的规模较大，DNA 的量甚至可以达到微克级别。

2.实现 DNA 完全去除的挑战与策略

要实现将 RNA 样品中的每一条 DNA 链都完全去除，几乎是一项难以完成的任务。因为 RT - PCR 技术具有极高的敏感性，能够从复杂的非匀质混合物中扩增单个分子。在进行 40 次以上的 PCR 反应循环后，即便在无逆转录的对照反应中，也几乎每次都会产生扩增条带，这充分表明了 DNA 污染的普遍存在。所以，在实验过程中，选择最为适宜的 DNase I 消化条件以及合理设定 RT - PCR 的循环次数显得尤为重要。为了最大程度地实现 DNA 的完全降解，应当采用特定的缓冲液。同时，在进行消化处理时，需注意不能使 RNA 浓度过高，应先将 RNA 样品稀释至约 100 µg/ml 以内再进行操作。DNase I 的使用量也需根据 DNA 污染的程度进行合理调整。

产品信息：深入探究 DNase I：特性、应用与关键问题解析

Vanecko, S and Laskowski, M (1961). J Biol Chem 236: 3312-3316.

Kunitz, M (1950) J. Gen Physiol 33: 349-362.

Moore, S (1981) Pancreatic DNase, in: The Enzymes (P.D. Boyer, Ed.) Academic Press, New York, Chapter 15.

Latham, G (Ambion, Inc.), unpublished data.

Sutton, DH, Conn, GL, Brown, T, and Lane, AN (1997) Biochem J 321 (Pt 2): 481-486.

Chomczynski, P, and Sacchi, N (1987) Anal Biochem 162: 156-159.

文章来源：深入探究 DNase I：特性、应用与关键问题解析

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来源：永不落的红黑心