摘要：如果我们要治疗某种疾病，比如遗传病或某些癌症，最直接的方式是把“对症下药”的分子直接送到细胞里，让它在细胞内部完成修复、调控或清除病灶的任务。听起来像科幻小说？但现代医学正在朝着这个方向狂奔！我们手中有越来越强大的生物大分子药物，比如能修改基因的“剪刀”——基
引言
如果我们要治疗某种疾病，比如遗传病或某些癌症，最直接的方式是把“对症下药”的分子直接送到细胞里，让它在细胞内部完成修复、调控或清除病灶的任务。听起来像科幻小说？但现代医学正在朝着这个方向狂奔！我们手中有越来越强大的生物大分子药物，比如能修改基因的“剪刀”——基因编辑器（gene editors）、指导细胞制造特定蛋白质的信使RNA (mRNA)、或者直接补充缺失功能的蛋白质。
然而，问题来了：我们的细胞可不是随便让谁都能进出的“开放大门”。细胞膜就像一层严密的安检，而即便进去了，药物也常常被包裹在“内涵体”（endosome）这个小泡泡里，最终被细胞的“垃圾处理厂”——溶酶体（lysosome）无情地分解掉。药物还没发挥作用就“壮烈牺牲”了！如何让这些生物大分子安全高效地“闯关”，从内涵体中逃逸出来，抵达细胞内部的工作场所（细胞质，cytosol），是当前药物递送领域最棘手的难题之一。现有的病毒载体（viral vectors）有安全和生产限制，而主流的脂质纳米粒（LNPs）虽然成功，但为不同类型的药物定制配方却非常耗时耗力，而且难以实现精准靶向。
有没有一种更通用、更“聪明”的递送系统呢？5月15日一项发表在《Nature Biotechnology》上的研究“Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins”，或许为我们揭示了未来的方向。研究人员另辟蹊径，设计了一种基于天然蛋白质——弹性蛋白（elastin）的纳米粒系统，他们称之为 ENTER (Elastin-based Nanoparticles for Therapeutic Delivery)。它巧妙地利用了弹性蛋白的温度响应特性，通过精巧的设计，将能帮助药物“逃离内涵体”的“秘密武器”——内涵体逃逸肽（Endosomal Escape Peptide, EEP）藏在纳米粒内部，只有在进入酸性的内涵体环境后才暴露出来，就像一个能感知环境并触发释放的微型“智能包裹”。更令人兴奋的是，通过计算模拟和筛选，他们还找到了比现有基准肽更强大的新型EEP！
这项研究表明，ENTER系统不仅能在体外将蛋白质、siRNA、mRNA和基因编辑工具高效、低毒地递送进多种细胞类型，包括关键的原代细胞，甚至在活体动物（小鼠肺部）中也成功实现了基因编辑！这为开发通用、安全、高效的细胞递送平台带来了令人振奋的曙光，预示着基因疗法、RNA疗法和蛋白质疗法或许很快就能搭乘这样的“细胞特快专递”，更精准地抵达病灶，为健康带来新的希望。
细胞递送的难题：药物如何跨越细胞壁垒？
细胞外面有一层坚固的细胞膜，细胞内部还有层层“关卡”。大分子药物进入细胞通常依赖于内吞作用 (endocytosis)，细胞膜会像吞噬泡一样将药物包裹起来，形成内涵体 (endosome)。问题是，内涵体随后会逐渐酸化并与溶酶体融合，很多药物在内涵体里就被降解了，还没来得及发挥作用。所以，药物需要想办法从内涵体中“逃逸”出来，进入细胞质（cytosol），这被称为内涵体逃逸 (endosomal escape)。这是一个巨大的挑战，也是许多潜在疗法难以实现的瓶颈。
ENTER登场：弹性蛋白纳米粒的自组装魔力
这项研究的研究人员将目光投向了一种天然蛋白质——弹性蛋白。弹性蛋白基多肽（Elastin-like polypeptides, ELPs）是由一种简单的重复肽段序列 (VPGXG) 组成的重组蛋白聚合物。它的奇妙之处在于具有热敏性 (thermally responsive)：在低温下可溶，但温度升高到一定阈值（相转变温度，T_t）以上时就会发生相分离，形成聚集体或胶束（micelles）。
研究团队利用ELPs的这一特性，设计了一种四嵌段ELP聚合物。想象一下它像一列有不同车厢的“列车”：一个亲水块 (hydrophilic block)作为“车头”，让纳米粒在水溶液中稳定；一个交联块 (cross-linking block)便于后续修饰；最重要的，一个疏水块 (hydrophobic block)作为“货舱”，以及一个特殊的内涵体逃逸块 (Endosomal Escape Peptide, EEP)作为“秘密武器”。当ELPs浓度超过一定值，并且温度适宜时（比如我们的体温37℃），这些ELP链就会自组装，亲水块朝外形成纳米粒的“外壳”，疏水块和EEP则藏在“核心”。
迭代优化：构建“聪明”的细胞快递员
研究团队的ENTER系统不是一蹴而就的，而是经过了四代（V1到V4）的迭代设计。
V1-ELP：最早的ELP系统，主要用于细胞外的药物递送，可以通过sortase酶（一种细菌转肽酶）将带有LPETG序列的蛋白连接到ELP上。实验显示，V1-ELP形成的纳米粒直径约60纳米，能被HeLa和HEK293细胞内吞，但需要氯喹（chloroquine，一种已知能促进内涵体逃逸的药物）的帮助才能实现蛋白递送（荧光蛋白递送效率在氯喹辅助下从接近0%提升到接近30%）。这表明V1-ELP能进入细胞，但内涵体逃逸能力不足。
V2-ELP：为了增强内涵体逃逸，研究者在ELP的疏水块中引入了组氨酸（histidine）。组氨酸在酸性环境下会质子化，增加亲水性。他们的设想是，当纳米粒进入酸性的内涵体时，组氨酸质子化会导致“货舱”的疏水性降低，“列车”解体，从而帮助“货物”逃逸。V2-ELP在pH值低于6时确实显示出胶束解体的现象。在HEK293-RFP（含有loxP-stop-loxP-RFP基因，Cre重组酶介导重组后会表达红色荧光蛋白RFP）细胞中，V2-ELP递送Cre蛋白（一种介导基因重组的酶，可用于验证细胞递送效率）的能力比V1-ELP有所提升，尤其是在氯喹存在的条件下（RFP阳性率从约10%提升到超过50%），这证实了组氨酸的作用，但仍需要氯喹辅助。
V3-ELP：进一步引入了EEPs。研究者在V2-ELP的N端（亲水块的“车头”）融合了五种不同的EEPs，包括Tat、S10等已知的内涵体逃逸肽。这些V3-ELP能形成稳定的纳米粒。在HEK293-RFP细胞中测试递送Cre蛋白时，带有S10或Tat EEP的V3-ELP效率最高，可以在浓度为16微摩尔ELP时实现约30%的RFP阳性率，但在这个浓度下观察到一定的细胞毒性。同时，他们还测试了不同的蛋白连接子（linker），发现一种对弗林蛋白酶（furin）敏感的连接子（GGSGGSRVRRGGSGGS）能提高Cre蛋白释放效率，这是因为弗林蛋白酶在内涵体中活跃。然而，N端融合的EEP暴露在外，可能会导致细胞膜破坏，从而产生毒性。
V4-ELP：为了降低毒性并更好地利用EEP，研究团队进行了关键的改进。他们将EEP移到了ELP的C端（疏水块的“车尾”），这样在自组装成纳米粒时，EEP会隐藏在疏水核心内部，被亲水外壳屏蔽。他们推测，只有当纳米粒进入内涵体、组氨酸质子化导致“货舱”解体后，藏在内部的EEP才会暴露出来，发挥内涵体逃逸功能，从而降低对细胞膜的非特异性破坏。同时，为了避免C端带正电的EEP与N端带负电的亲水块之间的静电吸引影响自组装，他们将N端亲水块中的谷氨酸（glutamic acid，带负电）替换成了丙氨酸（alanine）和甘氨酸（glycine），形成了新的V4-ELP结构。V4-ELP形成了直径约70纳米的单分散球形胶束纳米粒，负染透射电镜图像也显示了约30纳米的球形颗粒。
打开细胞大门：内涵体逃逸肽的寻觅与突破
尽管V3-ELP中的S10等EEP已能提高递送效率，但毒性仍是限制。V4-ELP的设计理念正是为了屏蔽EEP毒性。为了找到更强大的EEP，研究团队进行了一次大规模的计算模拟 (in silico screening)和体外筛选 (in vitro screening)。
他们首先构建了一个机器学习模型，基于已知内涵体逃逸肽的理化性质、结构特征和组成（如疏水矩、净电荷、两亲性α螺旋等），预测其递送效率。这个模型在测试数据集上的均方根误差（r.m.s.e.）为12.4，预测效果良好。随后，他们利用这个模型筛选了一个包含超过11000个α螺旋肽段的数据库。第一轮筛选发现一些候选肽段（如EEP5），但它们在V4-ELP平台上的Cre蛋白递送效率不如S10（S10在8微摩尔ELP浓度下使约44.1%细胞RFP阳性，EEP5仅约25.7%）。注意到表现较好的EEP（如EEP1和EEP5）富含赖氨酸（lysine），这可能是一个重要线索。
受此启发，他们进行了第二轮基于模型的筛选，重点寻找富含赖氨酸的α螺旋肽段。这次筛选取得了重大突破！他们发现了EEP13和EEP14等几个候选肽段，在V4-ELP平台上递送Cre蛋白的能力显著优于S10。尤其是EEP13，是一种由两个合成的抗菌肽组成的二聚体（通过GGSGGGS连接）。在HEK293-RFP细胞中，V4-ELP-EEP13在低至100纳摩尔的Cre蛋白剂量下（同时使用8微摩尔ELP）就展现出卓越的递送能力。单独比较V4-ELP-S10和V4-ELP-EEP13在不同ELP浓度下的性能，V4-ELP-EEP13显示出更高的最大递送效率。相较于基准肽S10，EEP13在计算模型预测的GFP递送效率上提升了48%。这项发现印证了通过屏蔽EEP毒性来发现更高效EEP的策略是可行的。
研究团队还通过用巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1，一种抑制内涵体酸化的药物）预处理细胞的实验证实，ENTER递送Cre蛋白的效率会显著降低，这强有力地支持了ENTER的内涵体逃逸机制依赖于内涵体酸化和组氨酸的质子化。
精准投递：蛋白质与基因编辑工具的实验成果
确定了优秀的纳米粒设计（V4-ELP-EEP13）和高效的EEP，接下来就是看它的实际递送能力了。
蛋白质递送：
HEK293细胞： V4-ELP-EEP13递送Cre蛋白的效果优于单独的S10肽段（在相似RFP阳性率下，所需ELP剂量比单独S10肽段低20倍以上）。与商品化的脂质体转染试剂Lipofectamine 3000相比，V4-ELP-EEP13在递送Cre蛋白方面表现相似甚至更优。这表明ENTER是蛋白质胞内递送的有效载体。
原代细胞：递送系统能否用于原代细胞是衡量其潜力的关键。研究团队在多种原代细胞中测试了V4-ELP-EEP13递送Cre蛋白的能力，这些细胞来自报告小鼠（Ai9小鼠，Cre重组酶介导基因重组后会表达红色荧光蛋白tdTomato）：
肺成纤维细胞 (lung fibroblasts)：ELP和Cre蛋白共处理后，tdTomato阳性细胞比例呈剂量依赖性增加，最高达到约70%。而Lipofectamine 3000递送效率则低于15%。
腹腔巨噬细胞 (peritoneal macrophages)： 在最佳剂量下，超过80%的细胞变为tdTomato阳性。
脾脏CD4+ T细胞：最高可达90%的细胞实现tdTomato阳性。
造血干细胞 (hematopoietic stem cells, LSK)：约20%的细胞变为tdTomato阳性。
在所有细胞类型和条件下，ELP相关的细胞毒性都非常低。
功能性蛋白质递送：ENTER不仅能递送酶，还能递送转录因子。研究者使用V4-ELP-EEP13将M1巨噬细胞的关键转录因子IRF5蛋白递送至小鼠腹腔巨噬细胞。共处理后，IRF5调控的关键促炎细胞因子基因（如Ifng, Il12b, Illb）表达显著上调，而单独使用ELP或IRF5蛋白则效果有限，这证明ENTER介导的胞内递送能实现功能性蛋白的作用。
基因编辑工具递送：
基因编辑（如CRISPR）在治疗遗传病方面潜力巨大，但将大型的核糖核蛋白复合物（RNP）递送进细胞是挑战。
Cas9 RNP：V4-ELP-EEP13能有效递送SpCas9 RNP（包含化学修饰的靶向HPRT1基因的sgRNA），在HEK293细胞中实现了约65%的基因编辑效率，与商品化LNP系统CRISPRMAX相当。
碱基编辑器 RNP：V4-ELP-EEP13与ABE8e碱基编辑器RNP（靶向HEK3基因的sgRNA）共孵育后，在HEK293细胞中实现了在靶位点两个碱基上的高效A>G转换，效率达到83%，在所测试的剂量下超过了CRISPRMAX。
这些结果强有力地表明，ENTER系统可以有效地将蛋白质形式的基因编辑工具递送进多种细胞类型，实现基因编辑功能。
核酸递送：让基因沉默和mRNA疗法成为可能
除了蛋白质和RNPs，ENTER能否递送核酸呢？研究人员假设V4-ELP的阳离子C端EEP不仅能促进内涵体逃逸，还能通过静电和物理作用包裹带负电荷的核酸（siRNA、mRNA、pDNA）。
siRNA递送：V4-ELP-EEP13和其二聚体（V4-ELP-(EEP13)2）都能有效包裹siRNA（凝胶电泳和RiboGreen实验显示，在ELP蛋白与siRNA摩尔比高于10时接近100%包裹率）。包裹siRNA的纳米粒直径略有增加（约10-20纳米），zeta电位仍为正值，说明大部分siRNA被屏蔽在内部。这些纳米粒能保护siRNA不被RNase降解。功能性实验中，V4-ELP-EEP13能将siRNA递送进表达绿色荧光蛋白（GFP）的HeLa细胞，实现约75%的GFP基因沉默（gene knockdown），与其二聚体相比在较高剂量下更有效。同时，它也能将靶向Gapdh基因的siRNA递送进小鼠肺成纤维细胞，实现约95%的mRNA表达下调，与RNAiMAX效果相当。细胞内吞路径研究表明，ENTER纳米粒的内吞主要依赖于网格蛋白介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis）和动力蛋白相关通路（dynamin-dependent pathways）。溶酶体示踪染料LysoTracker的荧光随时间减弱，提示纳米粒进入细胞后确实导致了内涵体/溶酶体膜的渗透性增加或破裂。
mRNA和pDNA递送：mRNA疗法（如新冠疫苗）和基因疗法（pDNA）潜力巨大。V4-ELP-EEP13同样能有效包裹mRNA（包裹效率在ELP:mRNA摩尔比高于150时接近100%）。在HEK293-RFP细胞中递送Cre mRNA时，V4-ELP-EEP13实现了最高86%的RFP阳性率，与商品化mRNA转染试剂MessengerMAX效果相当。递送Cre pDNA的效果也与脂质体Lipofectamine相当。有趣的是，研究者发现不同EEP在蛋白质和mRNA递送效率上表现出高度相关性（相关系数R=0.9062），这进一步支持了ENTER通过共同的内涵体逃逸机制介导不同大分子货物递送的观点。ENTER也能有效递送Cas9 mRNA或pDNA，实现基因编辑（mRNA编辑效率26%，pDNA编辑效率29%）。在原代细胞中，V4-ELP-EEP13也能有效递送Cre mRNA，使肺成纤维细胞和巨噬细胞分别达到54%和56%的tdTomato阳性率，且毒性很低。
体内显身手：肺部递送的振奋人心
前期的体外实验已经非常亮眼，那么ENTER在活体动物中表现如何呢？研究团队选择了一个重要的应用场景——肺部基因编辑，并以将Cre重组酶递送至小鼠肺上皮细胞为概念验证。他们通过鼻内滴注的方式给Ai9报告小鼠递送了V4-ELP-EEP13与Cre蛋白的混合物，或单独的Cre蛋白。
结果令人振奋：与单独使用Cre蛋白的对照组相比，接受ENTER共处理的小鼠肺部，无论是在大呼吸道（tdTomato阳性率达到25.4% ± 3.7% vs 对照组约5%）还是小呼吸道（tdTomato阳性率达到9.2% ± 0.9% vs 对照组约1%），上皮细胞的tdTomato阳性率（基因编辑效率）都显著提高。这表明ENTER能有效将Cre蛋白递送至肺部上皮细胞，实现基因编辑。值得注意的是，他们观察到多种重要的肺上皮细胞亚型都被成功编辑了，包括纤毛上皮细胞、分泌粘液的杯状细胞、Club细胞和基底细胞。同时，肺组织病理学评估显示，接受ENTER处理的小鼠肺部炎症反应非常轻微，安全性良好。与同样在活体小鼠肺部进行Cre蛋白递送测试的SM-102 LNP相比，ENTER显示出更优的递送效率。
这项研究展示的ENTER系统是一个非病毒、基于蛋白质的纳米粒平台，在递送siRNA、mRNA、pDNA、蛋白质和RNPs等多种生物大分子方面都展现出了高效的胞内递送能力。与LNPs等需要针对不同货物反复优化脂质配方和化学修饰不同，ENTER的优势在于其通用性 (versatility)——无需针对不同货物进行特殊改造。
此外，ENTER的许多特性都具有重要意义：
可大规模生产和低免疫原性： ELPs可以通过大肠杆菌（E. coli）重组表达，生产成本相对较低且易于放大。ELPs本身已被证明具有较低的免疫原性和良好的可重复给药性。通过相分离和层析等方法纯化并去除内毒素，可以确保递送系统的安全性。
降低毒性： 将高效的EEP隐藏在纳米粒核心，避免了其暴露在细胞膜表面造成的非特异性损伤，显著降低了细胞毒性，使得研究团队能够发现比传统S10肽段更高效的EEP13。
触发释放机制：基于组氨酸的pH响应性设计，确保了纳米粒及其内部的EEP和货物只有在酸性的内涵体环境中才解体暴露，实现了“按需释放”，这对于提高递送效率和降低脱靶毒性至关重要。
当然，ENTER系统目前仍有一些需要进一步研究和优化的方面。比如，如何实现高效的全身给药（systemic administration）？如何在血液循环中保持纳米粒的稳定性、避免非特异性吸附并实现对特定器官或细胞类型的靶向递送？如何进一步提高对核酸（尤其是pDNA）的递送效率？这些问题都需要未来的深入探索。
尽管如此，ENTER作为一种基于弹性蛋白的自组装纳米粒，凭借其通用性、高效的内涵体逃逸能力、低毒性、可大规模生产等潜力，为蛋白质和核酸药物的胞内递送开辟了一条充满希望的新途径。这项研究不仅发现了高效的内涵体逃逸肽EEP13，更为开发下一代通用型、智能化的药物递送平台奠定了坚实基础。也许在不远的将来，ENTER就能载着各种“细胞快递”，帮助我们更精准、更有效地治疗疾病。
参考文献
Eweje F, Ibrahim V, Shajii A, Walsh ML, Ahmad K, Alrefai A, Miyasato D, Davis JR, Ham H, Li K, Roehrl M, Haller CA, Liu DR, Chen J, Chaikof EL. Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins. Nat Biotechnol. 2025 May 15. doi: 10.1038/s41587-025-02664-2. Epub ahead of print. PMID: 40374955.
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来源：生物探索一点号1
