Cell丨LoxCode体内条形码技术成功揭示胚胎器官中外胚层的克隆命运

摘要：哺乳动物上胚层（epiblast）细胞的克隆命运仍是发育生物学的核心谜题。小鼠胚胎呈双层结构，由上胚层（epiblast）和下胚层（hypoblast）组成。上胚层细胞具有全能性，理论上可分化为所有胚胎和部分胚外组织，可以通过原肠胚形成过程（gastrul

撰文｜ Enigma

哺乳动物上胚层（epiblast）细胞的克隆命运仍是发育生物学的核心谜题。小鼠胚胎呈双层结构，由上胚层（epiblast）和下胚层（hypoblast）组成。上胚层细胞具有全能性，理论上可分化为所有胚胎和部分胚外组织，可以通过原肠胚形成过程（gastrulation）产生三胚层（three germ layers）。原肠胚形成前后的上胚层细胞虽处于不同潜能状态，但尚未分配到特定谱系。早期克隆追踪表明，部分上胚层细胞可贡献多个胚层，提示其位置可能影响命运选择，暗示上胚层细胞具有高度的位置和谱系可塑性。然而，由于缺乏在体内以单细胞分辨率长期追踪的技术，解析多能上胚层细胞的谱系特化机制仍具挑战。细胞条形码的技术进步使克隆谱系的追踪成为可能，在进一步增殖和分化之前，用独特的可遗传条形码标记细胞的祖细胞群。随后对产生细胞后代的多个克隆的条形码库进行比较，可以确定克隆关系。这些条形码技术包括前瞻性和回顾性方法，许多还允许同时评估单细胞的转录组和克隆起源，利用将细胞状态与细胞命运联系起来的能力，或确定克隆之间共享的分子特征。

近日，来自沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所（WEHI）免疫学部门和墨尔本大学医学生物系的 Tom S. Weber 和 Shalin H. Naik 等人在 Cell 杂志发表了题为 LoxCode in vivo barcoding resolves epiblast clonal fate to fetal organs 的研究成果。该研究开发了高度多样性的Cre重组酶驱动的 LoxCode 条形码，用于体内克隆谱系追踪，并实现大块组织和单细胞读数。通过在小鼠胚胎期第5.5天(E5.）的前原肠胚胎（pre-gastrulation embryos）上进行条形码标记，对E12.5胚胎的40种组织进行批量和单细胞分析，发现上胚层克隆对不同组织的贡献存在显著偏向性，部分克隆富集于血液、外胚层、间充质或肢体等组织。利用基于随机代理的胚胎发生模型和 LoxCode 条形码，研究揭示了组织发育的分支层次、细胞命运偏向的时间节点。单细胞读数揭示了上胚层在器官发育中的左右不对称性，包括左对右和肾对性腺的命运。该技术为解析胚胎发育和克隆生物学提供了全新工具。

研究人员首先设计了 LoxCode 盒。基于 Cre/ LoxP 细胞条形码的最优设计原理，通过 LoxP 和条形码配对插入片段的串行集成构建 LoxCode ，14个 LoxP 位点交替方向排列，每两个 LoxP 位点夹着一个8 bp或14 bp 的短条形码元件，最终形成包含14个 loxP 位点和13个短条形码元件的最终盒。在Cre重组酶诱导下， LoxP 位点之间的随机重组导致倒位和切除，使得DNA序列可产生超过300亿种条形码。

为了在E5.5对上胚层细胞进行标记，研究人员将 LoxCode 盒插入雌性小鼠的Rosa26安全港基因座（Rosa26 safe harbor locus），Cre-ERT2 融合基因插入雄性小鼠Rosa26基因座，两种小鼠杂交形成 LoxCode /Rosa26-Cre-ER胚胎。在胚胎E5.5阶段通过静脉注射（IV）低剂量的4-羟基他莫昔芬（4-OHT），激活Cre重组酶，诱导 LoxCode 生成，以最大限度地减少发育毒性并允许部分 LoxCode 重组，实现对上胚层细胞的条形码标记。并在发育至 E12.5 时，将胚胎解剖为40个组织 / 器官，分别用于批量条形码测序（PCR）和单细胞 RNA 测序（ scRNA -seq）。

研究发现，上胚层细胞克隆具有异质性和组织偏向性。通过从3个胚胎中回收 703 个条形码，多数克隆仅富集于特定组织。例如，12% 的克隆仅存在于血液（主要为卵黄囊来源的红细胞），20% 偏向脑组织，仅 5%为多谱系克隆。单细胞分析也显示，克隆在组织和细胞类型分布上存在显著偏性。例如，克隆 + 1+8−13 富集于肺、肠道和间充质组织，而 + 1−6+9 克隆主要贡献肢体的肌肉骨骼细胞。

随后，研究人员进一步研究了胚胎器官的谱系分支层次。通过MCSA分析，将组织按克隆相似性分为神经（脑、神经血管）、肢体（前肢、后肢）、间充质/器官（肾脏、性腺、肠道）和血液（独立于其他组织）四大类。谱系树显示，在E5.5后不久，血液谱系就最早从外胚层-中胚层共同祖细胞分离，约E6.5外胚层与中胚层分化，最后形成左右对称性和器官特异性（如肾脏与性腺的分离发生于 E9.5 后）。而随机代理模型显示，命运限制始于E5.5，完成于E9.5。晚期标记（E8.5）导致组织间克隆相似性显著下降，印证早期分支的重要性。

研究人员还揭示了分化在单细胞水平的不对称性。肾脏和性腺的克隆分布存在显著左右不对称性，约 70% 的克隆仅富集于左侧或右侧器官。例如，克隆−7+12+13 在左右性腺和肾脏中均富集，而 + 1−8+5 克隆特异性贡献肾脏间充质。对于细胞类型与谱系关系，转录组相似的细胞类型（如造血细胞与心脏细胞）可能共享克隆祖先，但肾脏与性腺体细胞的克隆关系与转录差异不一致，提示谱系关系与基因表达并非完全耦合。

综上，这项研究通过LoxCode技术首次系统解析了小鼠上胚层细胞的克隆命运图谱，揭示了上胚层克隆命运的复杂性和组织发育的层级结构，发现其命运偏向早在原肠胚形成前已部分建立，而非完全随机。这一结果表明LoxCode技术是解析体内克隆谱系的强大工具，为胚胎发育、造血系统和癌症克隆研究提供了新工具。未来结合 CRISPR 等技术，有希望进一步解析细胞命运决定的分子机制和动态过程。

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00461-1

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