摘要：骨类器官是模拟天然骨结构和功能的体外模型，依赖于3D干细胞培养进行自组织、分化、ECM分泌和生物矿化，最终形成矿化的胶原蛋白层次结构。然而，缺乏合适的基质限制了骨类器官的发展。

骨类器官是模拟天然骨结构和功能的体外模型，依赖于3D干细胞培养进行自组织、分化、ECM分泌和生物矿化，最终形成矿化的胶原蛋白层次结构。然而，缺乏合适的基质限制了骨类器官的发展。

为了解决这一问题，上海大学苏佳灿教授团队开发了由DNA和明胶甲基丙烯酰（GelMA）之间的氢键结合GelMA网络交联而设计的动态DNA/GelMA水凝胶（CGDE），以再现骨ECM的关键生化和机械特征，为骨类器官形成提供支持性微环境。

这突出了CGDE水凝胶作为骨类器官发育的强大和可扩展的平台，为骨生物学和骨组织再生的创新策略提供了新的见解。

文章介绍

题目：Dynamic GelMA/DNA Dual-Network Hydrogels Promote Woven Bone Organoid Formation and Enhance Bone Regeneration

期刊：Advanced Materials

影响因子：27.4

发表日期：2025年3月

#1

研究背景

Background

骨类器官是来源于干细胞的3D体外模型，提供了一种仿生方法来复制天然骨组织的复杂结构和功能。这些模型概括了骨发育的关键方面，并使基本生物过程的研究成为可能，如骨生成，骨重建。因此，骨类器官的发展由于其加速骨再生的潜力而受到越来越多的关注。

支架材料、细胞调控、构建策略和转化应用是骨类器官研究的四个关键方面，其中，支架材料直接影响骨类器官的发育。脱矿细胞外基质（ECM）和丝素支架等材料已被用于构建骨小梁和编织骨类器官。然而，这些方法通常无法完全复制3D细胞培养系统。

虽然3D打印和微流体技术解决了3D培养中的营养扩散挑战，人工设计可以直接影响细胞行为，但这可能会破坏细胞的自我排列和分布，从而损害类器官的自我组织并延迟骨整合和重塑。因此，需要一种能够准确复制体内骨微环境并支持自主3D细胞培养的整体基质。

基质的机械性质，特别是粘弹性，在调节干细胞命运和自组织中起着至关重要的作用，这对类器官发育至关重要。各种组织，重建的ECM，初始骨折血肿和再生骨的软骨痂表现出良好的粘弹性。由化学交联网络形成的GelMA水凝胶由于其与ECM的组成相似性而被广泛用作载有细胞的生物材料以促进骨组织再生。

然而，如果没有适当的粘弹性，水凝胶网络可能会限制正常的细胞过程，如形状变化、迁移和增殖，除非被工程化以进行受控的降解。因此，虽然具有足够的强度，但常规GelMA和其他化学交联水凝胶通常缺乏最佳骨类器官发育所必需的粘弹性。

引入非共价键，如静电相互作用或氢键，可以赋予化学交联的GelMA水凝胶动态特性。通过氢键交联的聚合物DNA水凝胶由于其受控的粘弹性和物理自组装而显示出支持3D细胞和类器官培养的前景，但它们缺乏作为骨类器官基质的足够机械强度。

胶原蛋白可以通过氢键直接结合DNA，形成自组装复合物。明胶是部分胶原水解的产物，预期与DNA类似地组装。因此，GelMA和DNA大分子的双网络水凝胶，结合DNA和GelMA之间的氢键与GelMA网络的化学交联，可以潜在地实现足够的机械强度和粘弹性。

#2

研究思路

Methods

该研究开发了GelMA/DNA双网络水凝胶，如图1所示。通过光引发后的非共价交联和共价交联的结合，形成了过氧化氢酶偶联的CGDE水凝胶，模拟骨ECM微环境。在DNA加入前后，评估前体溶液和水凝胶的粘弹性，以证明DNA和GelMA之间的非共价相互作用，并理论模拟进一步证实。

GelMA与过氧化氢酶（CAT）接枝，并引入仿生线粒体纳米矿物（EACP）以提供诱导干细胞成骨分化的生化线索，最后减轻3D培养中过量的活性氧（ROS）。

通过二维培养评价CGDE水凝胶作为骨类器官基质的潜力，显示出优异的生物相容性和成骨生物活性。还评估了CGDE水凝胶内3D负载的骨髓基质细胞（BMSC）的迁移和自组织。

在3D培养（CGDE-21 C）21天后，负载的BMSC重塑水凝胶基质，经历增殖、自组织和成骨分化，导致基于结构表征和细胞组分的存在鉴定为编织骨类器官（WBO）的细胞-基质构建体。跟踪CGDE水凝胶中WBO的顺序发展，并证实随后在体内重塑成板层骨。

此外，培养21天的构建体显示出最佳的成骨生物活性，证明了快速异位骨形成和与宿主骨缺损的快速体内骨整合。该研究中开发的CGDE水凝胶为三维骨组织培养提供了一个稳定的平台，并为设计用于骨组织工程的多功能基质奠定了基础。

图1. 动态CGDE水凝胶的设计和CGDE基质中用于骨组织再生的编织类骨器官（WBO）的开发示意图。

#3

关键研究结果

Results

1、CGDE水凝胶的制备与表征

选择GelMA/DNA双网络水凝胶作为基质。Y型支架DNA和DNA接头自组装成动态DNA网络，纯DNA溶液不形成稳定的水凝胶（图2a）。无定形磷酸钙（EACP）的加入引发了DNA中磷酸基团与磷酸钙中钙离子之间的离子交联，降低了DNA/EACP的流动性。

CGD、CGE和CGDE前体比GM和CG前体溶液的流动性更低，其粘度更高。紫外线照射固化GM、CG、CGE和CGDE水凝胶（图2b）。GM和CG水凝胶是透明的，而CGE和CGDE为乳白色。图2c中的低温扫描电子显微镜（Cryo-SEM）图像显示所有水凝胶中的孔隙率均良好。

在CGE孔壁上观察到EACP纳米颗粒，增加了孔径和孔壁厚度，并引起一些孔壁塌陷。CGDE水凝胶显示出更坚固的微观结构，促进细胞生长，证明了DNA在杂化水凝胶中的作用。图2d中的能量色散X射线光谱（EDS）分析证实了CGDE网络内均匀的EACP纳米颗粒分布。如图2e所示，CGDE水凝胶还显示出良好的自愈性能。水凝胶的两个切断面在没有任何进一步外力的情况下重新结合，恢复了水凝胶的结构。

评价了储能模量（G′）和损耗模量（G′′）、阻尼因子（tanδ）、复数粘度（η*）和应力松弛测试。如图2f所示，GM和CG水凝胶前体在高频率下都表现出G′和G′′的交叉点，G′在大多数频率范围内占主导地位。CGE水凝胶前体在整个频率范围内表现出G′>G′′，表明主要的弹性特征。然而CGDE水凝胶前体溶液在低频率下表现出G′>G′′，而在较高频率下G′′>G′，这意味着从凝胶状态到溶胶状态的转变。胶凝水凝胶的模量示于图2g中。在所有组中，G′与G′′没有任何交叉，表明水凝胶是一个稳定的固体状态，具有高度的结构和弹性的性能。

阻尼系数（tanδ）为G′′与G′的比值，可作为材料能量耗散和抗冲击性的指标。如图2h中所示，GM、CG和CGE水凝胶前体的tanδ保持在0.4-1，表明在大多数频率范围内较少的能量损失和主要的弹性行为。相反，CGDE水凝胶前体溶液的tanδ表现出更强的频率依赖性。氢键的自组装增强了粘性阻尼，导致分子摩擦增加。高频下的tanδ波动归因于氢键的动态断裂和重组，这进一步证明了CGDE水凝胶中氢键的存在。

在图2i中，所有水凝胶的tanδ下降到0.05以下，证明了优异的弹性性质和稳定的固体凝胶的形成。CGDE组的tanδ略低于CGE组，归因于GelMa和DNA分子链之间的缠结网络，这增强了水凝胶的弹性特性。

选择CGDE2作为后续研究的CGDE制剂。图2j中，所有前体溶液都表现出剪切稀化行为，其中粘度随着剪切速率的增加而降低。在所有组中，CGDE前体显示出最低的复数粘度和最平坦的斜率。凝胶化后，所有水凝胶组的粘度-频率曲线（图2k），显示出典型的非牛顿假塑性流体行为，具有优异的剪切稀化特性。

通过应力松弛测试进一步检查水凝胶的粘弹性。如图2l所示，CGE和CGDE水凝胶在5%的恒定应变下0.01s后仍表现出明显的应力松弛，而GM和CG水凝胶在0.01s后进入稳定应力阶段，残余应力为200 Pa。这表明EACP和DNA都可以增强本体水凝胶的粘弹性能。

CGE和CGDE在0.01~1000s内均处于缓慢应力松弛状态，1s后CGDE的应力明显低于CGE。在1000s时，CGDE的残余应力约为CGE的0.05倍。图2m中，观察到CGDE表现出对应变的快速响应，应力消散基本上在不到1s内完成，并且应力松弛速率显著高于其他组。而CGE的应力消散时间在500s之后。GM和CG组表现出相对较差的粘弹性，表明水凝胶中的弹性变形尚未完全转化为塑性变形。

图2 双网络凝胶GelMA/DNA的表征。

使用HDOCK服务器进行分子对接，进一步研究这些相互作用（图3a-c）。构建Y形DNA的3D模型，选择线性长度为43 nm且总长度为46 nm的胶原蛋白样肽的修复结构（图3a）。胶原蛋白样肽通过静电相互作用和氢键吸附到Y形DNA上（图3b）。特异性相互作用包括静电吸引，常规氢键，以及碳-氢键。

图3c所示的能量计算显示，总结合自由能为-100.16 kcal/mol，分子间作用力（VDWAALS）和静电（EEL）相互作用是主要贡献者。由于明胶中富含Pro和Hyp基序，这些结果表明Y形DNA和GelMA可以通过静电和氢键自组装，有助于CGDE水凝胶的动态性能和增强的粘弹性。

由此，在图3d中提出了动态双网络水凝胶形成的机制。在前体溶液中，GelMA和Y形DNA通过静电和氢键自组装。光引发后，形成化学交联的水凝胶网络。因此，所得CGDE水凝胶通过非共价（DNA-GelMA）和共价（GelMA-GelMA）键交联。这些组合的相互作用为CGDE水凝胶提供了骨类器官发育所需的适当粘弹性和机械强度。

图3 双网CGDE水凝胶形成机制涉及GelMA和Y形DNA之间的非共价相互作用。

2、动态CGDE水凝胶的细胞相容性和生物活性

为了评价CGDE水凝胶的生物相容性和成骨生物活性，从与水凝胶共培养的培养基中获得浸提液，并用于以下2D细胞培养实验（图4a）。各组培养的BMSC在培养时间内表现出正常增殖，各组间细胞活力无显著差异（图4b），表明GM、CG、CGE和CGDE表现出良好的生物相容性。

之后，进行RT-qPCR评价水凝胶的成骨作用（图4c），检测成骨相关基因的表达。与对照组相比，CGDE水凝胶显著增强了ALP、OSX-1、基因表达。此外，OSX显示出1.15倍的增加，RUNX2显示出1.14倍的增加。晚期成骨基质蛋白COL-1和OCN也显示出比对照组高约3-5倍的表达水平。

ALP是成骨细胞分化的早期表型标志物，而矿化结节则可通过茜素红（ARS）染色观察到。如图4d所示，ALP染色显示CG、CGE和CGDE组显著增强ALP活性。其中，CGDE组在促进BMSC中ALP表达方面表现出最显著的效果，而GM组对ALP活性没有显著影响。ARS染色图像（图4e）表明CG、CGE和CGDE组均显著促进BMSC中的矿化，其中CGDE组表现出最高水平的矿物质沉积。证实了CGDE基质的上级成骨潜力。

进一步使用WB评估了成骨相关蛋白表达，如图4f所示。与对照组相比，CGDE水凝胶的成骨蛋白表达水平明显升高。CGDE基质能够增强细胞内转录因子RUNX2和OSX的表达，并有效刺激细胞外基质中COL1和OCN的分泌。因此，所有的水凝胶都是生物相容的，而CGDE水凝胶显示出最好的成骨生物活性。

为了评价水凝胶对血管网络形成的贡献，在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）上进行划痕试验、迁移试验和血管形成试验。在划痕试验中（图4g），使用CGDE水凝胶浸提液处理的HUVEC的增殖和迁移率显著增强。与对照组相比，CG和CGE组的细胞迁移率均有所改善，但GM组与对照组之间无显著差异。

在血管形成测定中（图4h），在4小时内在所有水凝胶组中均形成血管网络。在这些组中，CGDE组显示出最明显的血管形成，具有更完整的网络闭合，而GM组显示出较低的完整性。CGDE水凝胶的上级管形成能力对于促进骨类器官中的血管生长至关重要，有助于增强体内骨重建。

使用脂多糖（LPS）在BMSC上诱导炎症，并评估水凝胶提取物对清除细胞内ROS的作用。LPS刺激组显示出显著的绿色荧光（图4i），表明BMSC内ROS的高生成。当LPS刺激的BMSC与水凝胶提取物一起培养时，CG和CGDE组显示出不可见的绿色荧光，表明细胞内ROS水平降低。

相比之下，GM和CGE水凝胶组中保留了明显的绿色荧光，表明这些水凝胶在清除ROS方面不太有效。进一步进行流式细胞术分析以检查BMSC中的细胞内ROS水平（图4j）。与GM和CGE水凝胶相比，CG和CGDE水凝胶表现出更少的ROS阳性细胞，这可以归因于接枝CAT的可降解性以及并入的DNA。

还使用RT-qPCR评估促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和抗炎因子（IL-10）的基因表达水平（图4k）。LPS刺激导致BMSC中促炎因子的显著上调，其中IL-1β增加最多。然而，当与水凝胶提取物一起培养时，促炎因子的表达显著降低，特别是在CG组中，其水平甚至低于对照组。CGE组促炎因子表达升高可能与纳米磷酸钙颗粒诱导的炎症反应有关。相反，与CGE组相比，将DNA引入CGDE组导致促炎因子的显著下调。

此外，在CGDE组中观察到抗炎因子IL10的显著上调，这在其他组中没有观察到，加强了DNA分子的强效抗炎作用。结合图2和图3，CGDE水凝胶提供了诱导BMSC成骨分化和清除ROS的生化线索，是用于骨类器官发育的有前景的基质。

图4 动态CGDE水凝胶的细胞相容性和生物活性。

3、CGDE水凝胶作为骨类器官发育基质的评价

为了评价CGDE水凝胶对骨类器官发育的适用性，使用三维细胞培养系统构建仿生骨组织（图5a）。细胞活力测定（图5b-d）显示，CGDE-21C表现出最高的活力，具有比其他组显著更多的活细胞。与GM-21C和CG-21C相比，CGE-21C显示出显著降低的活力。

图5b中的F-肌动蛋白染色揭示了CGDE水凝胶中有效的细胞骨架延伸，促进了细胞间通讯。CGE-21C显示出较不利的细胞骨架延伸（图5e），与活力结果一致。选择CGDE2作为进一步研究的CGDE制剂。

与HUVEC共培养（图5c-f）显示，CG-21C表现出最稳健的血管网络形成，而CGDE-21C显示较少的互连HUVEC和较不发达的血管网络。此外，CGDE-21C表现出显著较低的ROS水平，这证明了其作为3D培养基质的抗氧化活性。CGE-21C显示出最高的ROS水平，可能是由于EACP纳米颗粒。这些结果表明，在CGDE水凝胶中观察到的用于3D培养的优异的生物相容性和细胞骨架延伸与其动态结构提供的生化线索和粘弹性密切相关。

使用MicroCT表征构建体内的矿物质含量和分布（图5g）。对顶视图和侧视图的伪彩色分析，成骨诱导21天后，GM-21C和CG-21C表现出相似的矿化，主要来自BMSC分泌的生物矿物质。CGE-21C和CGDE-21C中较高的矿物质含量可能来自基质中的EACP和细胞分泌的矿物质。骨体积分数（BV/TV，图5h）和骨矿物质密度（BMD，图5i）的定量分析证实了CGDE-21C中较高的矿物质含量。

为了进一步验证CGDE-21C与编织骨的仿生性，进行免疫染色分析以检查与编织骨发育相关的关键细胞标志物。COL-1、OCN、OSX和PDPN的免疫染色证明CGDE-21C中成骨蛋白表达增加（图5l）。因此，CGDE-21C含有前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞特异性标记，表明该基质中的BMSC经历了协调的分化过程。

这种相互作用促进了包裹在矿化胶原基质中的相互连接的细胞网络的形成。生理编织骨的微结构由矿化基质和随机取向的胶原纤维与未成熟骨细胞定义，在CGDE-21C中得到了密切的再现。因此，CGDE-21C被定义为WBO，一种以新生骨组织的特征为特征的骨类器官。

图5 骨类器官3D培养基质水凝胶的评价。

4、动态CGDE水凝胶中的WBO开发

虽然WBO系统是通过21天的成骨诱导BMSC负载CGDE水凝胶开发的，但具体的开发过程需要进一步研究。BMSC在2D培养中的体外成骨分化通常遵循连续阶段：增殖（0-7天），基质成熟（7-14天）和矿化（14-21天）。

评价了不同时间点的结构特征和细胞活性（图6a）。从第0天到第21天，载有BMSC的CGDE水凝胶保持了良好的组织结构；然而，到第30天观察到构建体塌陷。图6a中的显微镜观察显示，到第7天细胞聚集成球形，随后分别到第14天和第21天细胞延伸和伪足形成。到第30天，伪足已经减少，细胞分散成簇。

3D活/死染色（图6b）和定量分析（图6c）评估细胞活性。在第0天，细胞适应基质，一些无活力的细胞被消除。到第7天，没有观察到死细胞。到第14天，活细胞的数量显著增加，到第21天形成相互连接的聚集体。到第30天，增加的细胞死亡表明进入终末分化阶段。

3D细胞骨架染色（图6b）和定量分析（图6d）显示第0天细胞骨架未发育，第7天出现微丝，第14天形成相互连接的微丝网络，使细胞通讯成为可能。到第21天，细胞骨架高度延伸；然而，微丝密度下降，细胞网络减弱到第30天。

使用Micro-CT观察WBO的成骨矿化过程（图6e）。最初CGDE水凝胶中的矿物质均匀分布。7天后，矿物质含量下降，基质降解发生。到第14天，矿物质含量的进一步减少与细胞活性的增强相一致。在第21天，矿物质含量逐渐恢复到甚至超过早期水平，到第30天达到峰值。BV/TV（图6f）和BMD（图6g）的定量分析证实了这些观察结果。

使用压缩测试评估发育中的WBO的机械强度，其受基质的生物化学和结构性质的影响并反映细胞-基质整合（图6h）。在第0天，抗压强度主要由CGDE水凝胶确定。基质溶胀和降解导致第7天抗压强度降低。到第14天，细胞增殖和自组织有助于增加机械强度。到第21天达到187 kPa的最大抗压强度，这可能是由于增强的细胞-基质整合。由于可见的结构塌陷，未对第30天的类器官进行测试。这些结果表明，WBO在第21天表现出最佳的机械强度、结构完整性、稳健的细胞活性和发育良好的细胞骨架。

组织学染色（图6i）进一步追踪了WBO的发展。H&E和Masson染色显示，在第7天，细胞被紧密包封在基质内，具有有限的活性。到第14天，细胞增殖、细胞骨架延伸和细胞连接增加。在第21天，增强的细胞活性和周围基质降解促进网络形成。到第30天，基质崩溃导致细胞解体和死亡。

ARS染色显示成骨细胞分泌的矿物质沉积在第14天开始，到第21天从细胞内沉积到细胞外沉积，到第30天完全矿化。图6j中所示的定量分析进一步证实了观察结果。

图6k中的免疫染色显示了WBO发育期间的蛋白水平变化。在第7天，OSX表达占主导地位，出现OCN表达和低COL-1水平。到第14天，OCN表达显著增加，COL-1开始分泌，分散在基质中。在第21天，OSX表达下降，而OCN和早期骨细胞标志物PDPN增加，COL-1包围细胞网络。到第30天，OSX表达几乎消失，晚期成骨标志物OCN、PDPN和COL-1占主导地位，表明终末分化。

图6 CGDE水凝胶中的WBO开发和生物活性的评价。

5、WBO异位成骨活性的评价

将不同发育阶段的WBO皮下植入免疫缺陷小鼠，以评估其成骨潜力和体内形成成熟骨组织的能力。如图7a所示，植入后4周，评价各组皮下骨组织的形成。目视检查（图7b）显示，在CGDE-0C组（负载BMSC）中，基质已大量降解，未观察到显著的骨组织形成。相比之下，CGDE-21C组表现出最高的成骨活性，皮下形成明显的白色矿化组织。CGDE-14C和CGDE-30C也表现出显著的成骨潜力，而CGDE-7C形成的骨组织量最少。

取出异位骨组织后，矿化组织呈乳白色白色，被纤维组织和血管网包围（图7c）。骨是高度血管化的组织，植入生物材料或骨类器官的血管化是其与宿主骨整合的关键指标。为了评估血管形成，对异位骨组织进行CD31免疫荧光染色（图7d）。CGDE-14C和CGDE-21C组显示出形成良好的血管网络，CGDE-21C中的血管更厚。CGDE-7C表现出最低的血管化，而CGDE-30C具有最厚的血管，但血管密度较低。WBO的血管生成主要取决于基质的降解。

异位骨组织的3D结构和矿物质含量通过图7e中的Micro-CT进行分析。CGDE-21C在体内表现出最高的成骨活性，形成具有均匀矿化的骨组织。相反，CGDE-7C被重塑成骨板样结构，而CGDE-14C则发育成中空的矿化组织。CGDE-30C的成骨能力降低，导致不规则的中空矿化组织。

图7f-g中的定量分析再次证实，CGDE-21C组显示BV/TV和BMD显著增加。因此，WBO的异位成骨活性在不同发育阶段是不同的。CGDE-21C类器官表现出最强的成骨潜力，形成血管化良好、矿化的骨组织，具有高BV/TV和BMD。

相比之下，CGDE-7C类器官显示出最少的成骨活性，形成最少的骨组织，血管化有限。这些结果强调了发育阶段在WBO的成骨性能及其整合到宿主组织中的能力中的关键作用。

图7 不同发育阶段WBO异位成骨活性的评价

6、动态CGDE水凝胶中WBO的形成机理

进行转录组测序以研究基质水凝胶在WBO形成中的调节机制。将CGDE-21C和CGE-21C皮下植入裸鼠，并分析4周后取出的异位组织。图8a中的差异基因表达分析鉴定了246个差异表达基因（DEG），与CGE-21C相比，CGDE-21C中有98个上调，148个下调。

图8b中前25个上调和下调基因的聚类热图分析显示，上调基因与细胞自组织、骨生成、血管生成和活性氧代谢相关，而下调的基因与炎症相关。CGDE-21C中上调基因的基因本体（GO）富集分析（图8c）揭示了生物过程如ECM组织、膜内骨化、血管发育和ROS代谢中的显著富集。KEGG富集分析进一步鉴定了CGDE-21C中DEG在免疫调节途径中的显著富集，包括精氨酸-细胞因子受体相互作用、IL-17信号传导和Toll样受体信号传导，MAPK信号传导途径显著上调，其调节细胞增殖和骨稳态（图8 d）。

在CGDE-21C和CGDE-7C之间鉴定了总共240个DEG，其中在CGDE-21C中81个基因上调，159个基因下调（图8e）。分层聚类显示，下调的基因主要与免疫系统相关（图8f）。CGDE-21C中上调的DEG的GO富集分析突出了诸如化学突触传递、骨骼系统形态发生和ECM组织的过程（图8g）。

KEGG通路分析表明，在与细胞自组织和通信相关的通路中，上调的DEG富集，支持WBO的顺序发展。还富集了与骨发育、免疫调节和造血相关的信号传导途径，包括JAK-STAT、T细胞受体和造血细胞谱系（图8h）。成熟的WBO（CGDE-21C）显著下调了适应性免疫应答，可能增强了它们与宿主骨组织的整合。

图8 体内培养4周的CGDE-21 C和CGE-21 C以及体内培养4周的CGDE-21 C和CGDE-7 C的转录组测序分析。

因此，如图9所示，CGDE水凝胶通过提供一种粘弹性基质来支持WBO的形成，所述粘弹性基质下调先天性免疫应答并增强细胞自组织化，这可能是通过MAPK信号通路激活实现的。

WBO的发生受多种信号通路的调控，其中JAK-STAT信号通路在维持细胞代谢和稳态中发挥重要作用，最终促进WBO的自组织。CGDE水凝胶中WBO的成熟部分再现了膜内骨化的生物学过程，这是颅骨和扁骨发育的基本过程。

图9 CGDE水凝胶通过提供一种粘弹性基质来支持WBO的形成。

7、WBO与宿主骨组织的体内整合

将不同发育阶段的WBO植入大鼠颅骨的临界尺寸缺损中以评估其体内骨整合（图10a）。Micro-CT分析（图10b）显示空白对照组（无植入材料）骨形成极少，CGDE-0C组仅在缺损边缘有少量新骨形成。WBO表现出增强的成骨能力。

21天WBO（CGDE-21C）组在4周后用新骨覆盖约50%的缺损区域。到12周，WBO逐渐与宿主骨组织整合，并重塑为更有序的板层骨。值得注意的是，CGDE-21C有效地促进了骨整合和愈合，而在空白组和CGDE-0C组中没有观察到显著的再生。BV/TV（图10c）和BMD（图10d）的定量测量进一步证实了WBO的快速骨整合和愈合潜力。

进行组织学分析以评价缺损部位的新骨形成。H&E和Masson三色染色（图10e）与MicroCT的观察结果一致。各治疗组缺损处均形成致密的纤维组织，空白对照组纤维组织稀疏，组织疏松。免疫荧光染色结果显示，WBO处理组的成骨相关蛋白表达均升高。早期成骨标志物OSX和晚期成骨标志物COL-1在CGDE-21C处理组中显著更丰富（图10e）。

这些结果表明，开发的WBO表现出用于颅骨缺损修复的上级生物活性，在CGDE-21C组中观察到峰值性能。

图10 WBO的体内生物活性评价。

结论

本研究开发了一种动态、双网络CGDE水凝胶，为骨器官发育提供了具有适当机械强度和粘弹性的大块基质。CGDE水凝胶通过GelMA网络中的共价键和DNA与GelMA之间的非共价相互作用而交联，表现出动态性质。作为骨组织基质，CGDE水凝胶模拟了机械微环境，并提供了诱导BMSC成骨分化的生化线索。

使用这些水凝胶，依次开发了编织骨器官（WBO）系统，部分重现了膜内骨化。粘弹性基质促进细胞自组织，可能通过MAPK信号通路激活，使细胞增殖、ECM分泌、矿化和细胞定向基质重塑的不同阶段成为可能。CAT有效地减轻了氧化应激，创造了有利于血管形成和炎症调节的微环境。WBO系统具有良好的时空结构和生物活性，可模拟生理编织骨，促进骨整合和骨缺损的有效修复。培养21天后，WBO表现出最高的机械强度、细胞整合和功能性，可作为体外板层骨重建的动态支架。

本研究为开发一个稳定、可扩展的骨器官发育平台提供了新的策略。这些发现突出了仿生、自组织系统复制复杂骨骼发育机制的潜力。除了骨修复外，WBO系统还为研究骨生理学、疾病和治疗干预提供了一种多功能模型。

未来的工作将集中在扩大该系统的临床应用，解决机械加固和血管化的挑战，并结合先进的工程技术，如与破骨细胞和/或内皮细胞共培养。本研究为仿生构建功能性骨类器官建立了新的基准，为再生医学的下一代解决方案铺平了道路。

参考文献

Zhu M, Zhang H, Zhou Q, Sheng S, Gao Q, Geng Z, Chen X, Lai Y, Jing Y, Xu K, Bai L, Wang G, Wang J, Jiang Y, Su J. Dynamic GelMA/DNA Dual-Network Hydrogels Promote Woven Bone Organoid Formation and Enhance Bone Regeneration. Adv Mater. 2025 Mar 23:e2501254. doi: 10.1002/adma.202501254.

来源：培养盒守护者