摘要：可用水减少40%导致小麦减产20.6%，鉴定小麦干旱响应基因并阐明其功能机制对提高小麦的耐旱性至关重要。广泛分布于植物中的转录因子家族AP2/ERF中有部分被鉴定到在干旱胁迫响应中起到关键作用。此外，WRKY转录因子在干旱胁迫响应中也起到关键作用。然而，转录因

据研究报道，可用水减少40%导致小麦减产20.6%，鉴定小麦干旱响应基因并阐明其功能机制对提高小麦的耐旱性至关重要。广泛分布于植物中的转录因子家族AP2/ERF中有部分被鉴定到在干旱胁迫响应中起到关键作用。此外，WRKY转录因子在干旱胁迫响应中也起到关键作用。然而，转录因子TaAP2/ERF和TaWRKY调节小麦耐旱性的具体分子机制仍不清楚。在拟南芥的研究中，AP2/ERF和WRKY转录因子通过调节ABA信号途径改变植株内ROS含量响应干旱胁迫。

近期发表在International Journal of Biological Macromolecules上的文章“The drought-responsive wheat AP2/ERF transcription factor TaRAP2-13L and its interacting protein TaWRKY10 enhance drought tolerance in transgenic Arabidopsis and wheat (Triticum aestivum L.)”以DREB A6亚家族基因TaRAP2-13L为研究对象，通过酵母双杂（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和GST pull-down等实验，证实了TaRAP2-13L与TaWRKY10的互作，及其在作物干旱胁迫中的响应机制。

研究结果

1. TaRAP2-13L和TaWRKY10的序列和启动子分析

作者在TaRAP2-13L的启动子区域上鉴定到了21个顺式作用元件，其中包括10个激素信号转导元件（如ABREs、ABRR-core、P-box、TGACG基序、CGTCA基序和TCA元件）、9个光响应元件（G-box、Sp1、GT1基序、MRE和ATCT基序）以及2个非生物胁迫响应元件（LTR、MBS）。在TaWRKY10的启动子区域上鉴定到了41个顺式作用元件，包括21个激素信号转导元件（如ABRE、TGACG基序、CGTCA基序、TGA元件和TCA元件）、13个光响应元件（G-box、Sp1、MRE、Box4和AE-box TCT基序）以及7个非生物胁迫响应元件（LTR、MBS、ARE和富含TC的重复序列）。因此，这两个基因可能参与激素信号传导、光反应和脱落酸反应。

2. TaRAP2-13L表达模式和转录活性分析

qRT-PCR结果表明，TaRAP2-13L在干旱条件（9 h，40.60倍）、PEG6000（1 h，16.63倍）、ABA（6 h，19.66倍）即盐处理（6 h，9.24倍）下表达显著上调，在低温（4℃）和高温（42℃）下表达下调（图 1A）。该结果证明TaRAP2-13L参与各种胁迫响应，尤其是干旱胁迫。亚细胞定位结果表明TaRAP2-13L定位于细胞核中（图 1B）。BD-TaRAP2-13L的酵母细胞在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上不生长，表明TaRAP2-13L在酵母中无自激活活性（图1C）。

图1. TaRAP-13L的表达模式分析、亚细胞定位和转录活性测定

3. 过表达TaRAP2-13L增强拟南芥耐旱性

作者对14-day龄的TaRAP2-13L过表达幼苗（OE1、OE2、OE5）干旱处理以评估耐旱性。图 2B表明野生型植株较过表达株系更枯黄。恢复正常浇水后，过表达株系的存活率显著高于野生型植株（图2C）。这些结果表明，过表达TaRAP2-13L增强了拟南芥的耐旱性。

为了进一步探究TaRAP2-13L增强耐旱性的分子机制，作者测定了正常和干旱胁迫下野生型和过表达株系叶片中过氧化物（ROS）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平。结果表明，在正常条件下，野生型和过表达株系之间这些指标无显著差异，而在干旱胁迫下，过表达株系的ROS和MDA水平显著低于野生型，SOD活性显著高于野生型（图2D-F），说明TaRAP2-13L的过表达增强了SOD活性，降低了MDA含量以及ROS的积累。在施加外源ABA的情况下，过表达株系的种子萌发率显著低于野生型（图3A和3C）。在添加了甘露醇模拟干旱环境的条件下，过表达株系的根长显著长于野生型（图3B和3D）。这些发现表明，TaRAP2-13L的过表达增加了外源ABA的敏感性，并提高了植株耐旱性。

图2. 拟南芥中过表达TaRAP2-13L降低了ROS水平并增强了干旱胁迫耐受性

图3. 拟南芥过表达TaRAP-13L增加了ABA敏感性、根长度并增强了耐旱性

4. TaRAP2-13L与TaWRKY10互作且共表达TaRAP2-13L和TaWRKY10增强了转录活性

作者通过酵母双杂实验（图4A）、BiFC（图 4B）、LCI（图4C）和GST-pull down实验（图4D）证实了TaRAP2-13L与TaWRKY10的互作。此外TaWRKY10的亚细胞定位和表达模式的结果表明TaWRKY10定位于细胞核（图 4E），且在干旱胁迫后1 h表达量达到峰值。

此外双荧光素酶活性测定实验证实，TaRAP2-13L与TaWRKY10互作会增强转录活性。实验结果表明，TaRAP2-13L在烟草中缺乏转录活性，TaWRKY10在烟草中能够驱动LUC活性。相较于TaWRKY10与阴性对照互作，TaWRKY10与TaRAP2-13L共表达显著增强了LUC活性。说明TaRAP2-13L可促进TaWRKY10的转录活性，且TaWRKY10可增加TaRAP2-13L的转录活性。且在干旱胁迫下，TaRAP2-13L和TaWRKY10共表达的转录活性进一步增强。

图4. TaRAP2-13L和TaWRKY10互作

图5. TaRAP2-13L和TaWRKY10共表达增强转录活性，尤其在干旱条件下

5. TaWRKY10过表达增强了拟南芥的耐旱性

通过干旱胁迫下的枯黄程度和恢复正常水分后的存活率可以看出，TaWRKY10的过表达确实提高了拟南芥的耐旱性（图6B-C）。且在干旱胁迫下，TaWRKY10过表达株系的ROS和MDA水平均显著降低，SOD活性显著升高。在施加外源ABA的强开下，TaWRKY10过表达株系发芽率显著降低，且在干旱条件下根长更长（图6D-F和7）。

图6. TaWRKY10在拟南芥过表达降低ROS水平增强耐旱性

图7. 拟南芥过表达TaWRKY10增强ABA敏感性并提高耐旱性

6. 小麦中TaRAP2-13L或TaWRKY10基因沉默

作者使用大麦条纹花叶病毒（BSMV-VIGS）在中国春小麦中沉默了TaRAP2-13L和TaWRKY10。沉默TaRAP2-13L或TaWRKY10后TaWRKY10的表达量显著降低（图 8B）。且基因沉默后的植株在干旱胁迫后相较野生型更枯黄（图 8C）。

此外，为验证TaRAP2-13L和TaWRKY10是否影响非生物胁迫相关基因的表达，作者检测了干旱胁迫5天后ABA合成相关基因TaNCED2-5A, TaNCED2-5B, TaNCEB2-5D，ROS合成基因TaNOX10，以及ROS清除基因TaSOD3-2A, TaSOD3-2D, TaPODA1, TaGPX1-2B, TaCAT1, TaCAT3和TaAPX2的表达，这些基因在沉默植株里的表达均显著下调（图9）。从中作者选择了4个具有代表性的基因（TaSOD3-2A, TaSOD3-2D, TaGPX1-D和TaNCED2-5B），并且分析了其启动子序列。结果表明AP2/ERF和WRKY的潜在结合位点基序G-box、DRE/CRT、GCC-box、GCC-boxlike和W-box在这四个基因的启动子上被鉴定到。随后，通过双荧光素酶实验证实了TaRAP2-13L和TaWRKY10均促进了TaSOD3-2A、TaSOD3-2D、TaGPX1-D和TaNCED2-5B的启动子活性（图10B）。而且TaWRKY10和TaRAP2-13L的共表达显著增加了这四个基因的LUC活性（图10C）。

上述结果进一步证实了，TaRAP2-13L和TaWRKY10通过共表达调控ABA合成基因来调节ABA水平，同时调节ROS清除基因的表达以提高小麦的耐旱性。

图8. 通过BSMV沉默TaRAP2-13L或TaWRKY10降低小麦耐旱性

图9. 干旱胁迫下TaWRKY10或TaRAP2-13L沉默植株中胁迫相关基因的表达水平

图10. TaRAP2-13L和TaWRKY10的潜在共调节下游基因

7. TaRAP2-13L直接结合TaSOD3-2A和TaSOD3-2D启动子，TaWRKY10直接结合TaSOD3-2A启动子

最后作者通过酵母单杂实验证实，TaRAP2-13L能够结合DRE基序，TaWRKY10能够结合W-box基序（图 11B），TaRAP2-13L和TaWRKY10均能结合TaSOD3-2A的启动子，仅TaRAP2-13L能结合TaSOD3-2D的启动子（图 11C）。

总结与讨论

在这篇文章中，作者鉴定了响应干旱胁迫的AP2/ERF转录因子TaRAP2-13L。通过酵母双杂筛选到与TaRAP2-13L互作的WRKY转录因子TaWRKY10，并通过BiFC、LCI和GST pull-down实验进一步证实了它们之间的互作。通过双荧光素酶测定揭示了TaRAP2-13L与TaWRKY10可结合TaSOD3-2A、TaSOD3-2D、TaGPX1-D和TaNCED2-5B的启动子以调节这4个基因的表达，且两个转录因子的共表达显著增强了转录激活。此外，酵母单杂实验证实，TaRAP2-13L与DRE基序和TaSOD3-2A及TaSOD3-2D的启动子结合，TaWRKY10与W-box基序和TaSOD3-2A的启动子结合。

来源：新浪财经