摘要：吉西他滨联合白蛋白紫杉醇（AG）是治疗胰腺导管腺癌（PDAC）的重要选择。然而，对化疗的反应相对较差，耐药发展迅速。最近的一项研究中，天津医科大学郝继辉团队揭示了改善PDAC的化疗耐药新机制，并制定了可使AG方案增敏的策略。该研究结果表明，以AVL9为靶点的药

吉西他滨联合白蛋白紫杉醇（AG）是治疗胰腺导管腺癌（PDAC）的重要选择。然而，对化疗的反应相对较差，耐药发展迅速。最近的一项研究中，天津医科大学郝继辉团队揭示了改善PDAC的化疗耐药新机制，并制定了可使AG方案增敏的策略。该研究结果表明，以AVL9为靶点的药物Edotecarin有望成为提高PDAC对AG敏感性的治疗策略。

文章介绍

题目：低氧和酸性肿瘤微环境驱动的AVL9通过AVL9-IκBα-SKP1复合物促进胰腺导管腺癌的化疗耐药

杂志：Gastroenterology

影响因子：25.7

发表时间：2024年11月

#1

研究背景

Background

目前，化疗耐药仍是PDAC治疗面临的最大挑战。近年来，AG已被推荐为PDAC2的标准治疗方案。然而，由于耐药的原因，对AG的反应并不令人满意。因此，探索PDAC的潜在治疗因子以克服化疗耐药是迫切需要的。多项研究表明AVL9可促进多种肿瘤的进展，但AVL9在PDAC中的作用尚未被探索。在这里，研究人员研究了AVL9在胰腺癌化疗耐药中的作用。发现肿瘤缺氧微环境导致AVL9表达升高，进而促进IκBα的降解和NF-κB的异常激活，从而增强肿瘤细胞的抗凋亡能力。此外，通过筛选抑制剂，为消除AG的化疗耐药性提供了一种有前景的靶向AVL9的药物。

#2

研究思路

Methods

研究人员使用了类器官模型、患者来源的异种移植（PDX）和基因工程小鼠模型，采用染色质免疫共沉淀、双荧光素酶实验、免疫共沉淀和western blot分析探讨其作用机制。通过蛋白结构分析和分子对接分析鉴定AVL9抑制剂，并在PDX、PDOX和KPC模型中验证其疗效。通过多策略筛选，研究人员发现AVL9是PDAC中AG耐药的关键靶点。在机制上，缺氧相关转录因子HIF-1α驱动AVL9的表达，AVL9可作为支架促进IκBα与SKP1结合，增强IκBα的泛素化和降解，进一步激活NF-κB通路。潜在的AVL9靶向抑制剂Edotecarin被证明可以逆转PDAC中的AG化疗耐药性。在PDAC中，AVL9的表达由HIF1α驱动。AVL9、IκBα和SKP1的物理相互作用为NF-κB通路的异常激活提供了新的分子机制。

#3

研究结果

Results

1. AVL9被确定为胰腺癌化疗反应的潜在靶点

研究人员使用四个独立的数据集创建了一个四步筛选策略：来自对AG有不同应答的晚期PDAC患者的PDOs、PDXs、细针穿刺（FNA）的RNA-seq数据，以及来自原发性PDAC的单细胞RNA-seq数据（CRA001160）。

在步骤1中，10例接受了全外显子组和转录组测序的患者的器官组织接受了AG治疗，然后使用细胞滴度Glo测定分析IC50值以评估其化疗反应。根据来自AG方案的IC50值将器官组织分为两组：敏感组（PDO1#-5#）和耐药组（PDO6#-10#），并对敏感组和耐药组的类器官进行了DEGs分析。第二步，对来自6例PDAC患者的体内PDXs进行AG处理。采用基于HE染色的肿瘤消退评分（TRG）评估其化疗反应，将TRG评分为1-2-3分的PDXs定义为敏感组，4 ~ 5分的PDXs定义为抵抗组，并进行了DEGs分析。第三步，6例PDAC患者接受2个周期AG方案新辅助化疗。对切除的肿瘤进行TRG评分，根据评分将这些类器官分为两组：敏感组（PDAC1#-3#）和抵抗组（PDAC4#-6#），并对FNA获得的原发性PDAC标本进行RNA测序，然后确定敏感组和耐药组之间的DEGs。第四步，从PDAC原发灶和癌旁组织中获取单细胞RNA-seq数据（CRA001160）进行降维，然后分析正常和恶性导管细胞之间的DEGs。

最后，对四个数据集的DEGs进行识别，取交集。对表达量增加的前10个基因进行评估，AVL9被确定为在PDAC中与AG耐药和生存预后相关的最具差异的过表达基因。此外，使用单细胞RNA测序数据（CRA001160）确认了其表达模式。在其他公共数据集中（GSE28735，GSE62452，GSE71729）也证实了AVL9在PDAC肿瘤组织中的表达增加（图1）。基于这些实验研究和生物信息学分析，研究人员确定AVL9是改善PDAC中AG耐受性的潜在靶点。

图1 AVL9被确定为胰腺癌化疗反应的潜在靶点

2. AVL9在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义

研究人员收集了肿瘤和癌旁组织，检测AVL9在PDAC中的表达，发现AVL9在肿瘤中过表达，并且在64对肿瘤中有较高水平，这被TCGA数据证实。此外，AVL9低表达患者的总生存期和无复发生存期较长。在两个队列中进一步验证发现，AVL9高表达与接受AG方案新辅助化疗的患者早期肝转移和无进展生存期下降相关。此外，与AVL9-low组相比，AG在AVL9-high组中的IC50值显著较高。研究人员使用随机选取的6例患者的手术肿瘤组织构建PDX模型，根据AVL9的表达水平将其分为两组，发现与AVL9-low组相比，AVL9-high组的肿瘤重量抑制显著降低（图2）。结果表明AVL9的高表达与PDAC患者的不良预后和化疗耐药相关。

图2 AVL9在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义

3. 肿瘤AVL9在体内外促进PDAC的化疗耐药

通过评估AVL9在原代细胞系中的表达和创建稳定细胞系，研究人员在低、中表达水平的细胞系中过表达AVL9，在中、高表达水平的细胞系中下调AVL9的表达。发现过表达AVL9增加了AG的IC50，而敲除AVL9则降低了该值。在AG缺失的情况下，AVL9的异位表达不影响肿瘤细胞的增殖或凋亡。然而，在AG处理过程中，它降低了细胞凋亡率，而敲低AVL9导致细胞凋亡增加。AVL9在正常条件下对细胞生长的影响最小，但在AG治疗期间提高了细胞存活率。在正常条件下，AVL9不改变DNA损伤或凋亡相关蛋白，但在AG处理下敲低AVL9导致γ-H2X和Cleaved-Caspase3水平升高。为了进一步研究AVL9是否可以解释PDAC在体内的化疗反应，研究人员构建了KPC小鼠AVL9纯合缺失（KPCA）。出生2个月后，将KPC和KPCA小鼠随机分为两组：vehicle组和AG组。检测发现，经AG处理后，KPCA的肿瘤负荷明显低于KPC。此外，研究人员发现经AG处理后，KPCA小鼠中cleaved-caspase3标记的肿瘤凋亡显著增加。在一项平行的生存试验中，研究人员在接受AG治疗的KPCA小鼠中观察到显著的生存获益（图3）。综上所述，体内外实验结果提示肿瘤AVL9促进了PDAC的化疗耐药。

图3 肿瘤AVL9在体内外促进PDAC的化疗耐药

4. 缺氧相关转录因子HIF-1α驱动PDAC中AVL9的表达

研究人员对4例患者的新鲜肿瘤组织进行了scRNA-seq，分析了24,410个细胞，发现HIF1α的特异性表达与AVL9的阳性相关。检测发现AVL9和HIF1α mRNA水平之间存在强的正相关关系，并且在肿瘤组织中存在正的IHC相关性。低氧条件下HIF-1α和AVL9的mRNA和蛋白水平均升高。用HIF-1α抑制剂KC7F2处理后，AVL9的表达显著降低。计算分析显示在AVL9启动子处有一个强有力的缺氧反应元件（HRE）。染色质pull-down实验显示HIF-1α与AVL9启动子结合。荧光素酶实验也证实HIF1-1α增加了AVL9启动子的活性。因此，在PDAC中，以其在缺氧中的作用而闻名的HIF-1α很可能调节了AVL9的表达。分析胰腺导管腺癌组织中AVL9的表达和乳酸水平，以确定乳酸对AVL9表达的影响，结果显示AVL9评分与乳酸含量呈正相关。在癌细胞培养物中添加25 mM乳酸，随着时间的推移，AVL9 mRNA水平增加，并提高总泛乳糖基赖氨酸（Kla）的表达。研究人员还研究了组蛋白的乳糖化是否促进AVL9的表达，发现乳酸处理增加了AVL9和H3K18la的水平。靶向乳酸转运蛋白的抑制剂AR-C155858显著降低了AVL9和H3K18la的表达。抗H3K18la抗体的ChIP显示，H3K18la在AVL9启动子区域富集（图4）。这些发现表明，TME中缺氧相关的乳酸蓄积通过H3K18la诱导AVL9表达。

图4 低氧环境可促进PDAC中AVL9的表达

5. AVL9通过诱导IκBα泛素化蛋白酶体降解和P6核转位增强PDAC的化疗耐药

为了研究AVL9如何增强胰腺癌细胞的化疗耐药性，研究人员对PDX-vector/AVL9-OE细胞系进行了RNA-seq和GSEA分析。值得注意的是，NF-κB信号通路在AVL9-OE细胞中高度富集，AVL9过表达可增强P65的核转位，但不影响IKKβ、IκBα或P65的磷酸化。此外，AVL9在不影响IκBα mRNA水平的情况下降低了IκBα蛋白水平，表明在翻译调节中起作用。CHX处理证实AVL9促进IκBα降解，MG132处理逆转了AVL9对IκBα稳定性的影响。AVL9还增加了IκBα泛素化水平，IκBα-KO实验表明，AVL9可以抵消AVL9的化疗耐药效应（图5）。综上所述，AVL9通过促进IκBα泛素化和促进P65核转位增加PDAC的化疗耐药性。

图5 AVL9通过诱导IκBα的泛素化-蛋白酶体降解和P65的核转位增强PDAC的化疗耐药性

6. AVL9促进IκBα与SKP1结合，从而介导IκBα在PDAC中的泛素化-蛋白酶体降解

已知IKK1和IKK2介导IκB降解和NFκB修饰。然而，AVL9不影响IKKβ、IκBα和P65的磷酸化水平，表明在高AVL9水平的PDAC中，IκB的降解可能独立于IKK发生。为了验证假设，研究人员使用CRISPR/Cas9技术构建了ikkβ缺陷的PDX细胞系。然后用AVL9-OE或shAVL9质粒转染这些细胞系，发现AVL9通过一种不依赖于IKKβ的机制促进IκBα的降解并促进PDAC的化疗耐药。为了探究AVL9在调控IκBα稳定性中的作用，研究人员通过亲和纯化和质谱分析与AVL9相互作用的蛋白。免疫共沉淀实验显示，在PDX细胞系中，Flag-AVL9与MYC-IκBα共沉淀，MYC-IκBα也可与Flag-AVL9共沉淀。此外，研究人员观察到了内源性相互作用。研究人员还发现AVL9与SKP1相互作用，并直接与SKP1和IκBα结合。MG132处理增加了SKP1与IκBα的结合，敲低SKP1抑制了AVL9介导的IκBα的降解，表明AVL9通过促进IκBα与SKP1的结合来增强IκBα的降解。为了确定结合区域，截断研究发现AVL9-Domain4（aa 380-600）和SKP1-Domain3（aa 114-145），以及AVL9-Domain4和IκBα-Domain3（aa 182-211）有相互作用。体外实验证实，敲除AVL9的关键结构域（aa 380-600）可消除其化疗耐药作用（图6）。这些发现为精确靶向AVL9以克服PDAC的化疗耐受性提供了新的见解。

图6 AVL9促进IκBα与SKP1的结合

7. 分子对接分析发现，Edotecarin可干扰AVL9与SKP1的相互作用，从而增加PDAC对AG方案的敏感性

考虑到AVL9-SKP1复合体在PDAC化疗耐药中的重要作用，通过分子对接分析筛选干扰AVL9与SKP1相互作用的潜在抑制剂。AVL9和SKP1相互作用位点的几个候选配体被确定。其中，拓扑异构酶I抑制剂Edotecarin的亲和力得分最高。免疫共沉淀验证了Edotecarin可以显著取消SKP1和AVL9之间的物理相互作用。接下来，研究人员使用SynergyFinder2.0在PDO模型中分析了Edotecarin和GEM的联合作用。Edotecarin与GEM的综合协同评分表明，在测试的浓度范围内，Edotecarin和GEM表现出协同的细胞毒性作用。此外，AG联合Edotecarin可以明显诱导凋亡标志物（Caspase3/7）的表达。与KPCAVL9-WT组相比，AG能显著抑制KPCAVL9-KO组的胰腺肿瘤负荷，而Edotecarin能显著消除这种差异。胰腺肿瘤的Cleaved-Caspase3染色也显示了类似的结果。在平行生存试验中，KPCAVL9-KO组可以从AG中获得比KPCAVL9-WT组更多的生存获益，而KPCAVL9-KO组在AG+ Edotecarin处理后未能获得更长的生存时间。在体内，研究人员使用了几种临床前小鼠模型，包括PDOX、PDX和KPC。将荧光素酶标记的PDO原位移植到裸鼠体内，并随机分为4组。检测发现与单药治疗相比，联合治疗显著降低了肿瘤负荷。此外，Edotecarin和AG的联合使用导致了更高的肿瘤细胞凋亡率。更重要的是，联合用药组患者的生存时间更长（图7）。以上证据表明，在临床前小鼠模型中，Edotecarin可使PDAC对AG增敏。

图7 分子对接分析发现，Edotecarin可干扰AVL9与SKP1的相互作用，从而增加PDAC对AG方案的敏感性

小结

该研究证实了AVL9为胰腺癌化疗反应的潜在靶点，机制方面，研究人员发现NF-κB通路与AVL9的表达呈正相关。进一步的体外实验证明AVL9可通过促进P65核转位和激活NF-κB通路诱导AG耐药，而IκBα的降解是P65核转位的关键步骤。此外，AVL9依赖于SKP1促进IκBα降解。分子对接分析发现，Edotecarin可干扰AVL9与SKP1的相互作用，从而增加PDAC对AG方案的敏感性。

参考文献

Ding, J., et al., Hypoxic and acidic tumor microenvironment-driven AVL9 promotes chemoresistance of pancreatic ductal adenocarcinoma via the AVL9-IκBα-SKP1 complex. Gastroenterology, 2024. DOI: 10.1053/j.gastro.2024.10.042.

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来源：培养盒守护者