摘要：大家好！今天要和大家分享一项关于蜱的有趣研究——《Phase separation and ageing of glycine-rich protein from tick adhesive》发表于《Nature Chemistry》。蜱在吸食宿主血液时，会分

大家好！今天要和大家分享一项关于蜱的有趣研究——《Phase separation and ageing of glycine-rich protein from tick adhesive》发表于《Nature Chemistry》。蜱在吸食宿主血液时，会分泌一种唾液，其中富含甘氨酸的蛋白质（GRP）起着关键作用。但此前其液体到固体的转变机制一直未知。这项研究深入探索了GRP的特性，包括其序列、相分离行为、老化过程等，为我们揭开蜱唾液蛋白质的神秘面纱，让我们一同走进这个微观世界，探寻蜱粘附的奥秘。

*本文只做阅读笔记分享*

一、研究背景

生物粘合剂在自然界中广泛存在，众多生物利用它们实现附着、捕食、运动等多种功能。然而，许多生物粘合剂的具体粘附机制仍不明确。蜱作为一种重要的寄生虫，其唾液中的蛋白质在形成稳固附着结构（水泥锥）方面起着关键作用，但其中的奥秘尚未完全揭开。此前研究发现，GRP在蜱唾液中含量丰富，且可能与水泥锥的特性有关，而内在无序蛋白质（IDPs）常与液-液相分离（LLPS）相关，这一现象在许多生物的粘附过程中发挥重要作用，因此促使研究人员深入探究蜱GRP在水泥锥形成中的潜在作用。

二、研究结果

（一）GRP的序列分析表明其为无序蛋白

研究人员选取了蜱唾液中的一种GRP（UniProtQ4PME3），其成熟序列tick-GRP77富含甘氨酸（约26%），同时含有大量非极性（约44%）和极性（约36%）氨基酸，疏水（约7%）和芳香族（约9%）残基相对较少。通过AlphaFold预测，其信号肽为α-螺旋，其余部分无序。IUPred算法及其他算法也证实tick-GRP77为高度无序蛋白。CIDER分析显示，tick-GRP77序列与许多已知的相分离IDR-包含蛋白相似，这表明它具有很强的LLPS倾向。例如，像FUS等蛋白也具有类似的无序特征并能发生相分离。

（二）Tick-GRP77通过简单凝聚发生LLPS

1、实验证据

合成tick-GRP77后，利用液滴蒸发实验模拟蜱唾液分泌过程。将缓冲后的tick-GRP77溶液（16-500μM）滴在亲水玻璃片上，随着蒸发，液滴边界处蛋白质浓度增加，最终形成凝聚物。例如，在32μMtick-GRP77溶液的蒸发实验中，可观察到液滴边界处荧光增强，随后出现相边界，形成凝聚物。

增加初始蛋白浓度会缩短凝聚开始的时间，如从16μM增加到128μM时，凝聚时间从12.7±0.7min缩短到7.5±0.9min。

表面钝化实验表明盐在促进相分离中起重要作用，如tick-GRP77在140mMNaCl中能形成凝聚物，而在Milli-Q水中则不能。

2、凝聚物性质

观察到tick-GRP77凝聚物的融合行为，如两个相似大小的凝聚物接触后融合成更大的球形凝聚物。通过分析融合过程中液滴的纵横比变化，计算出逆毛细管速度为0.92sμm⁻¹，表明凝聚物在一定时间尺度上表现为液体。

实验证实了LLPS过程的可逆性，如32μMGRP在PBS中形成凝聚物后，结晶样品经再水化可重新溶解，再次蒸发又能形成LLPS。

（三）LLPS主要由精氨酸和芳香族残基驱动

1、蛋白片段研究

将tick-GRP77分为N端（20-51）和C端（52-96），二者均无序且甘氨酸含量相近，但N端富含酸性氨基酸（净电荷-3.4），C端富含碱性氨基酸（净电荷2.5）。在相同条件下，C端凝聚速度更快（ti = 9min）且倾向于润湿玻璃表面，N端凝聚速度与tick-GRP77相似（ti = 13min）。这表明C端的阳离子-π和π-π相互作用更强，是LLPS的关键促进因素，而N端的静电排斥使其凝聚起始延迟。

2、突变体研究

合成C端的突变体（ΔFY和ΔR），发现芳香族氨基酸（F和Y）对诱导C端相分离至关重要，精氨酸（R）在驱动相分离中起更重要作用。例如，ΔFY突变体（50μM）凝聚变弱（ti = 7min），ΔR突变体（50μM）几乎不发生凝聚。这表明二者对tick-GRP77的LLPS均起主导作用。

3、化学干扰实验

尿素实验表明氢键在GRP凝聚过程中起积极作用，因为N端和C端凝聚物在约0.5M尿素存在下立即溶解。

1,6-己二醇实验显示疏水相互作用也参与LLPS，N端凝聚物在约15mM1,6-己二醇中溶解，C端凝聚物在约70mM1,6-己二醇中才开始溶解，完全溶解需约140mM。

（四）Tick-GRP77在磷酸盐存在下形成凝聚物

1、磷酸盐的影响

添加Na2HPO4可使tick-GRP77立即发生凝聚，通过实验得到相图，表明凝聚与蛋白浓度和孵育时间有关。例如，1M Na2HPO4存在下，63μM和125μMtick-GRP77溶液可瞬间凝聚，16μM溶液在1.5h孵育后也能形成凝聚物。

在拥挤环境（添加聚乙二醇）下，较低浓度的磷酸盐即可引发LLPS。如5%wt/volPEG（8kDa）存在时，0.5M磷酸盐就能使125μMtick-GRP77瞬间发生LLPS。

2、微流控实验

微流控实验中，tick-GRP77溶液与Na2HPO4溶液在芯片内相遇时，立即在界面形成凝聚物，且凝聚物在通道壁上变形，进一步证明了盐诱导的凝聚现象。

（五）Tick-GRP77凝聚物发生液-凝胶转变

1、液-凝胶转变现象

高浓度tick-GRP77（125μM）在Na2HPO4中孵育较长时间（5.5h）后，凝聚物的融合被阻止，形成稳定的簇，表明发生了液-凝胶转变。

2、FRAP实验验证

荧光恢复实验（FRAP）对比新鲜（0.5h）和老化（18h）的凝聚物，发现二者均表现出部分荧光恢复，表明GRP分子在凝聚物内运动受限，具有粘弹性行为；老化样品的荧光恢复率显著降低（新鲜样品约49%，老化样品约2%），表明其从液态转变为固态。通过计算得到新鲜样品的松弛时间τfresh = 160s，扩散系数Dapp约为-2.2×10-3μm2s-1，粘度约为42Pas，界面张力约为-46μNm-1，表明凝聚物为高粘性液体，能形成粘弹性网络并随时间老化，与蜱水泥锥形成过程相关。

3、粘附性测量

力谱测量表明，空气干燥的tick-GRP77凝聚物具有高粘附性，其粘附功Wadh为Wadh = 1.4×102 Jm-2，比非凝聚条件下（1.31×102 Jm-2）高四个数量级，可能在蜱的粘附中起关键作用。

（六）天然蜱唾液显示蛋白质凝聚物的证据

1、唾液提取与分析

从自然栖息地收集蜱（Ixodesricinus），提取未吸血雌性成虫的唾液腺内容物，SDS-PAGE分析显示提取物中有多种蛋白质条带。

2、凝聚物观察

显微镜观察发现多个唾液腺提取物中有微米级球形液滴，液滴融合事件表明其为液体性质。排除了液滴为脂质或脂肪滴的可能性。高盐浓度下出现纤维状结构，荧光标记实验表明这些结构富含蛋白质，暗示唾液中可能存在GRP丰富的凝聚物。比较tick-GRP77与其他蜱唾液中的GRPs，发现其氨基酸组成和模式相似，表明tick-GRP77的凝聚机制可能是一种更普遍的转变途径。

三、研究讨论

1、GRP在蜱水泥锥形成中的作用及生物粘附机制的普遍性

GRP通过LLPS和老化形成凝胶状粘附结构，可能在蜱的水泥锥形成中起关键作用。其他生物的粘合剂也涉及液-固转变，如天鹅绒虫的粘液蛋白和贻贝的足蛋白等，理解蜱GRP的相变可能揭示生物粘附蛋白的共同原理。

2、未来研究方向

分泌蛋白易发生翻译后修饰，其对GRP的影响值得研究；蜱唾液中的酶可能参与交联，有助于硬化过程，也需进一步探索。

GRP的粘附和生物相容性使其有望用于开发医疗密封剂；干扰GRP相变抑制水泥锥形成或开发抗蜱疫苗是控制蜱的潜在策略；基于GRP的凝聚物作为抗蜱疫苗载体也是有前景的研究方向。

通过这一系列研究，我们对蜱唾液中GRP的相分离和老化过程有了更深入的理解，这不仅有助于我们进一步探索蜱的生物粘附机制，也为开发新型蜱控制策略和生物医学应用提供了重要的理论基础。

四、一起来做做题吧

1、以下哪种生物的生物粘合剂机制在研究前相对清楚？

A. 蜱

B. 贻贝

C. 沙堡蠕虫

D. 天鹅绒虫

2、Tick - GRP77 中含量最高的氨基酸种类是。

A. 甘氨酸

B. 丙氨酸

C. 谷氨酸

D. 精氨酸

3、在液滴蒸发实验中，tick - GRP77 凝聚物形成的先后顺序是。

A. 液滴边界处蛋白质浓度增加→相边界形成→凝聚物出现

B. 相边界形成→液滴边界处蛋白质浓度增加→凝聚物出现

C. 凝聚物出现→液滴边界处蛋白质浓度增加→相边界形成

D. 液滴边界处蛋白质浓度增加→凝聚物出现→相边界形成

4、对于 tick - GRP77 的 LLPS 过程，以下哪种残基起主导作用？

A. 酸性残基

B. 碱性残基

C. 精氨酸和芳香族残基

D. 疏水残基

5、在添加的实验中，以下关于 tick - GRP77 凝聚的说法正确的是。

A. 低浓度的在短时间内就能使低浓度的 tick - GRP77 凝聚

B. 高浓度的在长时间孵育下才能使高浓度的 tick - GRP77 凝聚

C. 1M 存在时，较低浓度的 tick - GRP77 在短时间内可凝聚

D. 无论浓度如何，都不能使 tick - GRP77 立即凝聚

6、以下哪个实验结果最能表明 tick - GRP77 凝聚物发生了液 - 凝胶转变？

A. 凝聚物在高浓度下融合形成网络结构

B. FRAP 实验中老化样品荧光恢复率降低

C. 凝聚物在盐诱导下形成稳定簇

D. 力谱测量中凝聚物的粘附功较高

7、以下关于天然蜱唾液中蛋白质凝聚物的说法，错误的是。

A. 未吸血蜱唾液中也可能存在蛋白质凝聚物

B. 高盐浓度下唾液提取物中会出现纤维状结构

C. 提取的唾液腺内容物中蛋白质条带都对应 GRP

D. 显微镜观察到唾液提取物中有微米级球形液滴

8、以下哪项不是未来关于蜱 GRP 研究的方向？

A. 探究翻译后修饰对 GRP 的影响

B. 研究 GRP 在其他生物中的功能

C. 探索干扰 GRP 相变抑制水泥锥形成

D. 开发基于 GRP 的抗蜱疫苗载体

参考文献：

Ganar, K.A., et al. Phase separation and ageing of glycine-rich protein from tick adhesive. Nat. Chem. (2024).

来源：知识泥土六二三