摘要：外泌体作为天然的细胞间信号载体，在肿瘤诊断、治疗监测中具有独特优势。外泌体荧光标记可用于在体外或体内追踪外泌体的去向、摄取、分布和功能。常用的外泌体荧光标记染料主要分为两大类，一类是结合到细胞膜脂质区域上的脂溶性染料；另一类是能够完全嵌入目标膜的脂质双层并跨膜
外泌体作为天然的细胞间信号载体，在肿瘤诊断、治疗监测中具有独特优势。外泌体荧光标记可用于在体外或体内追踪外泌体的去向、摄取、分布和功能。常用的外泌体荧光标记染料主要分为两大类，一类是结合到细胞膜脂质区域上的脂溶性染料；另一类是能够完全嵌入目标膜的脂质双层并跨膜的水溶性共轭寡电解质（Conjugated Oligoelectrolytes，COEs） 。
COEs这种材料不仅具备优异的光学稳定性，能有效抵抗活体环境中的光漂白与代谢降解，还拥有良好的水溶性与生物相容性，可避免对细胞产生毒性影响；同时，其分子结构可灵活调控，能通过特异性相互作用与外泌体稳定结合，显著提升标记效率并降低背景信号干扰。
一篇发表在 Advanced Materials 的文章中，研究人员就利用这种荧光材料 NIR-II COE（命名为 COE-BBT），用于小鼠肿瘤进展的长期追踪。与传统的外源性示踪剂相比，COE-BBT 的 NIR-II（近红外二区）发射会随着肿瘤的生长而逐渐增加，成功实现小鼠肿瘤 14 天无毒性追踪及微环境动态监测。
这些结果证明了 COE 作为生物相容性非侵入性荧光探针的潜力，可用于体内长期监测生物过程。通过将外泌体与 COEs 精准结合，可构建出高效标记、长期示踪、精准定位的追踪体系。
宇玫博深耕外泌体领域，专注提供外泌体提纯及荧光染料相关解决方案。基于水溶性共轭寡电解质（COEs）的荧光标记染料 Aco-490，Aco-600，标记效率与示踪效果优异，已被数十篇领域内权威期刊如《Journal of Extracellular Vesicles》、《Theranostics》等引用，成为外泌体研究优选工具，适配各类外泌体荧光追踪场景。
为了进一步验证这款染料的性能，我们使用 Aco600 染料（Umibio UR52423）对外泌体进行标记，与受体细胞共孵育，通过激光共聚焦显微镜观察外泌体被靶细胞的摄取情况。以下是实验流程，操作步骤可供您的实验进行参考。
1. 外泌体荧光标记并去除游离染料
1.1. 用 PBS 将提取的外泌体浓度调整到约 1 × 1011 Particles /mL
1.2. 配制染色孵育体系
1.3. 去除游离染料
●染色完成后，于生物安全柜中加入 600 μL PBS在样品里，使用 100 KDa 超滤管，以 3,000 ×g 的离心力离心 5～10 min，进行超滤置换，去除溶液中游离的染料，将上室样品浓缩至原体积
●重复置换 2 次
●收集超滤管上室的样本,送检 NTA（50 μL）、BCA（50 μL）
2. 细胞共孵育
2.1. 提前 24 h 铺 24 孔板（先放置细胞爬片)，将细胞悬液浓度调整为适当浓度，每孔加入 300 μL 细胞悬液，约 2 × 104 个细胞
2.2. 避光操作：用无血清培养基将染色样本 EVs 浓度调整为适当浓度
2.3. 吸除待处理细胞原有的培养基，用 PBS 清洗两次
2.4. 避光操作：加入 300 μL 含染色 EVs 的新鲜培养基，染色 EVs 的粒子数约为 1 × 1010 个/孔，在细胞培养箱避光孵育 24 h
3. 细胞染色
3.1. DIO 细胞膜染色
● 孵育 24 小时后，弃去孵育液，用 PBS 清洗细胞 3 次
● 配制所需染色工作液体积
● 加入 300 μL 染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞
● 37℃ 避光孵育细胞 8 min
● 吸除细胞膜染色工作液，或 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min
● 使用 4% 多聚甲醛在室温下固定 10 min 后观察细胞形态
● 弃去 4% 多聚甲醛，用 PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 min
● 取出细胞爬片，用含 DAPI 封片剂进行封片
● 激共聚焦拍照
3.2. 细胞骨架染色
● 使用 4% 多聚甲醛在室温下固定 15 min 后观察细胞形态
●（不透化）加入 0.1% Triton X-100 透化 5 min 后用 PBS 清洗细胞 3 次
● 配所需染色工作液体积
● 37 避光孵育细胞 30 min
● 吸除染色工作液，再用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min
● 激共聚焦拍照
我们发现，外泌体与 MCF 细胞共孵育 24 h 后，在激光共聚焦拍摄下结果呈现令人满意（细胞骨架染和细胞膜染）。
实验分组：Aco600：仅染料组；EVs：仅外泌体组；Aco600+ EVs ：外泌体染色组。
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内容策划：王丹琦
内容审核：吴军
题图来源：图虫创意
文中图片均来源于宇玫博，未经允许不得取用
参考文献
[1] Zhou C, Li Z, Zhu Z, Chia GWN, Mikhailovsky A, Vázquez RJ, Chan SJW, Li K, Liu B, Bazan GC. Conjugated Oligoelectrolytes for Long-Term Tumor Tracking with Incremental NIR-II Emission. Adv Mater. 2022 May;34(20):e2201989. doi: 10.1002/adma.202201989. Epub 2022 Apr 18. PMID: 35306702.
[2] Zhou C, Cox-Vázquez SJ, Chia GWN, Vázquez RJ, Lai HY, Chan SJW, Limwongyut J, Bazan GC. Water-soluble extracellular vesicle probes based on conjugated oligoelectrolytes. Sci Adv. 2023 Jan 13;9(2):eade2996. doi: 10.1126/sciadv.ade2996. Epub 2023 Jan 11. PMID: 36630497; PMCID: PMC9833659.
来源：健康活你我他
