摘要：我们能否像编写计算机代码一样，去编程人类的细胞？这并非科幻小说的情节，而是细胞治疗领域正在发生的深刻变革。以CAR-T细胞疗法为例，通过基因改造，我们赋予了免疫T细胞识别并猎杀癌细胞的“超级能力”，在血液肿瘤治疗中取得了革命性的突破。然而，这把强大的“基因剪刀
我们能否像编写计算机代码一样，去编程人类的细胞？这并非科幻小说的情节，而是细胞治疗领域正在发生的深刻变革。以CAR-T细胞疗法为例，通过基因改造，我们赋予了免疫T细胞识别并猎杀癌细胞的“超级能力”，在血液肿瘤治疗中取得了革命性的突破。然而，这把强大的“基因剪刀”——CRISPR-Cas9，在“剪切与粘贴”的同时，也带来了一系列隐忧。它所依赖的DNA双链断裂 (Double-Strand Breaks, DSBs) 机制，就像是在细胞基因组这本精密无比的生命天书上动刀，稍有不慎就可能导致染色体易位、大片段缺失，甚至引发新的癌变风险。尤其当我们需要同时改造多个基因以应对实体瘤的复杂挑战时，这种风险会呈指数级增长。
我们能否找到一种更温和、更安全的方式来调控基因，一种更接近于“软件编程”而非“硬件改造”的策略？
10月21日，《Nature Biotechnology》的研究报道“Integrated epigenetic and genetic programming of primary human T cells”，为我们揭示了这样一种可能。研究人员开发了一套全新的、基于RNA的表观遗传编辑 (epigenetic editing) 平台。这套系统能够在不损伤DNA链完整性的前提下，持久而精准地“开启”或“关闭”人类T细胞中的特定基因，实现了对细胞功能的深度编程。更令人振奋的是，他们成功地将这种“软件”优化与传统的基因“硬件”升级相结合，创造出功能更强大、更持久的CAR-T细胞，为攻克癌症和自身免疫性疾病带来了全新的曙光。这不仅仅是一次技术的迭代，更可能是一场细胞工程学思想的范式转移。
想象一下，你想关闭房间里的一盏灯。你可以选择直接剪断电线，这很有效，但过程粗暴且不可逆，还可能引发短路。或者，你可以轻轻按下墙上的开关，灯灭了，电路完好无损，随时可以再次打开。传统的CRISPR-Cas9基因敲除 (knockout)，在某种程度上就像是“剪断电线”，它通过制造DNA双链断裂来永久性地破坏基因。而表观遗传编辑，则更像是那个优雅的“开关”。
表观遗传学关注的是在不改变DNA序列本身的情况下，通过化学修饰（如DNA甲基化、组蛋白修饰等）来调控基因表达的机制。这些修饰就像是给基因贴上的“开”或“关”的标签，决定了基因能否被读取。研究人员此前已经开发出一种名为CRISPRoff的工具，它将失活的Cas9蛋白 (dead Cas9, dCas9)，一个只定位不切割的“导航器”，与一系列表观遗传修饰酶（DNA甲基化酶）融合在一起。当它被引导到特定基因的启动子区域时，就会在那里“写入”一个永久性的“关闭”信号（即DNA甲基化），从而实现基因的持久沉默。
然而，将这一技术从实验室里的永生化细胞系应用到临床级别的人类原代T细胞 (primary human T cells) 上，却面临着巨大的挑战。原代细胞远比细胞系娇贵和复杂，如何高效、安全地将CRISPRoff系统递送到细胞内，并确保其效果持久稳定，是亟待解决的核心问题。
为此，研究团队进行了一系列精细的优化工作。他们摒弃了可能引起免疫排斥的病毒载体，选择了一种更安全、瞬时表达的“全RNA平台”。他们设计并比较了七种不同的CRISPRoff信使RNA (mRNA) 版本，通过调整mRNA的帽子结构 (cap modifications)、碱基修饰 (base modifications) 和密码子优化 (codon optimization) 等参数，最终筛选出了一款效力最强的版本——CRISPRoff 7。这款优化后的mRNA，即使在很低的剂量下，也能实现高效的基因沉默。
那么，这个“表观遗传开关”的效果究竟如何？研究人员将其与另外两种技术进行了正面交锋：传统的CRISPR-Cas9基因敲除和另一种表观遗传沉默技术CRISPRi（它通过空间位阻暂时性地阻碍基因转录，但效果会随时间消失）。他们选择了三个T细胞表面蛋白基因CD151、CD55和CD81作为靶点。
实验结果清晰地展示了CRISPRoff的优越性。在长达28天、历经三次T细胞再刺激的严苛考验后，CRISPRoff处理的细胞中，目标基因的沉默率依然高达93%以上，其效果与直接敲除基因的Cas9技术不相上下。相比之下，CRISPRi技术的效果在细胞分裂和刺激后迅速减弱，到第28天时，基因表达几乎完全恢复。这有力地证明了CRISPRoff所建立的表观遗传沉默是可遗传的、持久的，能够经受住T细胞在体内可能经历的长期增殖和激活考验。
一个优秀的基因编辑工具，不仅要“打得准”，还要确保“不伤及无辜”。为了评估CRISPRoff的特异性，研究团队动用了两种强大的全基因组分析技术：转录组测序 (RNA-seq) 和全基因组亚硫酸氢盐测序 (Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)。RNA-seq的结果显示，在沉默CD55或CD81基因28天后，整个细胞的基因表达谱中，除了目标基因被显著下调外，几乎没有其他基因受到影响。这说明CRISPRoff的脱靶效应极低。而WGBS则从更根本的DNA甲基化层面揭示了其精准性。数据显示，在沉默CD55的细胞中，新增加的DNA甲基化信号被精确地限制在CD55基因的启动子区域，就像一支训练有素的特种部队，只在指定的战区执行任务，而不会在基因组的其他地方留下任何痕迹。
这些数据共同描绘了一幅令人信服的画面：研究人员已经拥有了一个高效、持久且极其精准的基因“关闭”工具，它实现了“永久关机”，却完美地避开了“剪断电线”的风险。
CRISPRoff在沉默CD151、CD55这些基因时表现出色，一个共同的特点是它们的启动子区域富含CpG二核苷酸，形成了所谓的“CpG岛” (CpG islands, CGIs)。这些区域是DNA甲基化天然的“温床”，因此CRISPRoff在这里写入“关闭”信号可谓事半功倍。
但这引出了一个更深层次的问题：在人类基因组中，并非所有基因都拥有这样的“风水宝地”。许多对T细胞功能至关重要的基因，尤其是那些编码免疫检查点蛋白（如PD-1、LAG3）的基因，其启动子区域并没有典型的CpG岛。CRISPRoff能否在这些基因组的“无岛之境”中同样有效地建立并维持沉默？这不仅是一个技术问题，更直接关系到该技术在肿瘤免疫治疗中的应用前景。
为了回答这个问题，研究人员选择了一系列缺少CpG岛的靶点基因，包括CD5, LAG3, PDCD1 (编码PD-1蛋白), ENTPD1 (编码CD39蛋白) 和PTPRC (编码CD45蛋白)，这些基因在T细胞耗竭、功能调节中扮演着关键角色。他们使用CRISPRoff系统对这些基因进行沉默，并在超过30天的时间里持续追踪其表达变化。
实验结果呈现出一种复杂而有趣的模式，远非简单的“行”或“不行”。
对于CD5和LAG3，CRISPRoff的表现堪称惊艳。即使没有CpG岛，沉默效果也异常稳定和高效。在实验进行到第30天时，经过多次刺激，超过99%的细胞仍然完全检测不到这两种蛋白的表达，其效果甚至优于Cas9基因敲除。这表明，在某些非CpG岛的基因座上，CRISPRoff同样可以建立起坚如磐石的表观遗传记忆。
对于大名鼎鼎的免疫检查点PD-1，结果也相当理想。在超过30天的时间里，PD-1的表达被稳定地抑制，约78%的细胞保持了沉默状态。虽然效率略低于Cas9敲除（约90%），但考虑到其安全性优势，这无疑是一个非常有吸引力的结果。
然而，当目标转向CD39和CD45时，挑战开始显现。对CD39的沉默表现出“部分稳定”的特性：起初效果很好，但随着时间的推移，一部分细胞开始重新表达CD39，尽管在第35天仍有超过一半（53%）的细胞维持沉默。而对于CD45，沉默效果则是“不稳定”的。在处理后7天内，沉默效果就迅速减弱，到第24天时，基因表达几乎完全恢复到了未处理的水平。
为什么会出现如此大的差异？这种差异性是否隐藏着更深层的规律？研究人员通过仔细分析这些基因启动子周围的DNA序列，发现了一个重要的线索：沉默的稳定性与靶点区域附近的CpG二核苷酸密度密切相关。
他们绘制了一张图表，将所有测试基因（包括有CpG岛和无CpG岛的）的沉默稳定性（从实验开始到结束，蛋白表达的变化倍数）与基因转录起始位点 (Transcription Start Site, TSS) 周围±500个碱基对内的CpG数量进行了关联分析。一个清晰的趋势浮现出来：CpG密度越高的基因，其沉默效果就越稳定、越持久。而CD45，这个最难被稳定沉默的基因，其启动子周围的CpG含量是所有靶点中最低的。
这一发现极具价值。它不仅解释了实验结果的差异性，更为未来应用CRISPRoff技术提供了宝贵的指导原则。它告诉我们，表观遗传编辑并非“一招鲜，吃遍天”，其效果受到目标基因座自身特征的深刻影响。这促使我们去思考，对于那些“顽固”的、CpG稀疏的基因，我们是否需要设计出第二代表观遗传编辑器，比如融合一些能够招募其他抑制性复合物的蛋白，来共同加固这个“关闭”信号？
在与癌症的战斗中，单打独斗往往难以取胜。尤其是在面对实体瘤时，肿瘤微环境中充满了各种抑制免疫细胞功能的“刹车”信号。要想让CAR-T细胞这样的“超级士兵”发挥最大战力，我们往往需要同时解除多个“刹车系统”，比如同时敲除PD-1、LAG3等多个免疫检查点基因。这就对基因编辑工具的多任务处理能力 (multiplexing) 提出了极高的要求。
然而，正如前文所述，使用Cas9同时在基因组上制造多个DNA双链断裂，是一件风险极高的事。每一次断裂都可能出错，当多个断裂同时发生时，细胞的DNA修复系统可能会不堪重负，导致染色体片段错误连接，引发大规模的基因组不稳定性，最终结果往往是细胞毒性，细胞无法承受如此剧烈的“手术”而走向凋亡。
这正是CRISPRoff这类非切割性工具展现其核心优势的舞台。由于其作用机制不涉及DNA断裂，理论上，它可以同时在基因组的多个位点写入“沉默”标记，而不会增加细胞的遗传毒性负担。
为了验证这一设想，研究人员设计了一场直接的对比实验。他们分别使用CRISPRoff和Cas9，尝试在T细胞中同时沉默三个、四个甚至五个非必需的表面蛋白基因。实验5天后，他们检测了活细胞的数量。
结果的差异是惊人的。在对照组（只进行电穿孔，不加任何编辑工具）和CRISPRoff处理的细胞中，活细胞数量没有显著差异，无论CRISPRoff是靶向三个、四个还是五个基因。这表明CRISPRoff的多重编辑对细胞的生存几乎没有影响。
反观Cas9组，情况则截然不同。当Cas9同时靶向三个基因时，细胞毒性已经开始显现。而当靶向四个或五个基因时，活细胞数量相比对照组出现了断崖式下跌，分别减少了约40%和50%。这直观地展示了多重Cas9切割所带来的巨大细胞毒性。
在证明了安全性之后，效率又如何呢？CRISPRoff能否在保证细胞存活的同时，有效地完成多任务指令？研究人员在处理后的第5天和第30天，通过流式细胞术检测了多基因沉默的效率。
即使在最复杂的五基因同时沉默任务中，CRISPRoff的表现也相当出色。在第30天，也就是经过了多轮细胞分裂和增殖后，仍然有高达65.8%的细胞成功地将所有五个目标基因全部沉默。对于四基因和三基因沉默，这一比例更是分别达到了82.4%和93.5%。研究人员还进一步分析了针对三个具有重要治疗潜力的靶点（FAS, RC3H1, SUV39H1）的多重沉默效果，发现在转录本水平上，这三个基因均被高效抑制了约80%。
这些数据共同证明，CRISPRoff平台具备了优雅而强大的多任务处理能力。它能够在不引起细胞毒性的前提下，高效、持久地同时沉默多个基因，完美解决了传统Cas9技术在多重编辑应用中的核心痛点。这为开发更复杂、更强大的细胞疗法铺平了道路，我们可以想象，未来的CAR-T细胞或许可以被“编程”为同时关闭多个耗竭信号，抵抗肿瘤微环境的抑制，并敲除引起移植物抗宿主病的基因，成为一个真正意义上的“全能战士”。
一个完整的细胞编程工具箱，不仅需要一个可靠的“关闭”开关，还需要一个精准的“开启”开关。在很多情况下，我们的目标不是沉默某个基因，而是要唤醒一个对治疗有益的、但处于休眠状态的基因。例如，在治疗自身免疫性疾病时，我们希望能增加调节性T细胞 (Regulatory T cells, Tregs) 的数量或功能，而这类细胞的核心“身份标识”是一个名为FOXP3的转录因子。
在常规的辅助性T细胞 (Conventional T cells, Tconvs) 中，FOXP3基因通常处于被甲基化抑制的沉默状态。如何安全、稳定地激活它，将普通T细胞转化为具有免疫抑制功能的Treg细胞，是该领域的一个长期目标。
为此，研究团队将目光投向了他们工具箱里的另一件法宝，CRISPRon。与CRISPRoff相反，CRISPRon是将dCas9与一种DNA去甲基化酶TET1融合在一起。当它被引导到被甲基化的基因区域时，可以擦除“关闭”信号，从而重新激活基因的表达。
然而，激活FOXP3基因的挑战在于其调控的复杂性。研究人员没有采取常规思路去直接靶向基因的转录起始位点 (TSS)，而是采取了一种更为巧妙的策略。他们注意到，在FOXP3基因的内含子区域，存在一个被称为“Treg特异性去甲基化区域” (Treg-Specific Demethylated Region, TSDR)的关键增强子 (enhancer)。这个区域在真正的Treg细胞中是完全去甲基化的，但在Tconvs细胞中则被高度甲基化，正是这把“表观遗传锁”锁住了FOXP3的稳定高表达。
研究团队假设，使用CRISPRon精准地为TSDR这个“隐秘的远端开关”解锁，或许比直接去撬动TSS这个“主门锁”更为有效。
他们从健康人血液中分离出CD4+ Tconvs细胞，然后用CRISPRon系统分别靶向FOXP3的TSDR区域、TSS区域，或是一个不相关的安全港位点 (AAVS1) 作为对照。
实验结果完美地验证了他们的假设。当CRISPRon靶向TSDR时，FOXP3蛋白的表达水平显著上升。在电穿孔9天后，表达FOXP3的细胞比例从未处理的约4%增加到了约11%，提升了近两倍。而直接靶向TSS区域，却几乎没有引起任何FOXP3的表达变化。
更重要的是，这种激活效应是持久的。即使在28天后，经过了多轮培养和刺激，CRISPRon-TSDR处理组的细胞仍然维持着显著高于对照组的FOXP3表达水平。通过靶向亚硫酸氢盐测序，研究人员证实，在这些细胞中，TSDR区域的甲基化水平确实被显著降低，而TSS区域的甲基化状态则没有变化。
这个实验的意义远不止于成功激活了一个基因。它深刻地揭示了表观遗传编辑的巨大潜力：我们不仅可以调控基因本身，还可以通过精准操纵远端的调控元件（如增强子）来对基因表达进行精细编程。这就像一个高明的电工，不仅知道总开关在哪里，还了解墙壁内每一条线路的走向和每一个分控开关的功能。这种对基因调控网络的深度理解和干预能力，为细胞工程开辟了全新的维度，使得诱导产生具有特定功能的细胞类型（如Tregs）成为可能，为治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症等自身免疫性疾病带来了非病毒、非转基因的新策略。
至此，研究人员已经分别展示了他们强大的基因“关闭”和“开启”工具。但真正的“杀手级应用”，在于能否将这套精密的“表观遗传软件”系统，与传统的“基因硬件”升级无缝集成，从而创造出1+1>2的效果。
在CAR-T细胞治疗中，最前沿的“硬件升级”技术之一，是将CAR基因精准地插入到T细胞受体α恒定区 (T cell receptor alpha constant, TRAC) 的基因座上。这样做的好处是，CAR的表达可以受到内源性TCR调控网络的精密控制，能够有效减少CAR-T细胞的过度激活和耗竭，提升其持久性。
研究团队的目标，就是将这种精准的CAR基因敲入 (knock-in)，与CRISPRoff介导的功能增强型基因沉默结合起来。他们选择了一个极具潜力的靶点——RASA2。此前的研究发现，敲除RASA2基因可以显著增强T细胞对微弱抗原信号的敏感性，并提升其在长期战斗中的持久杀伤功能。
然而，这个“终极融合”策略面临一个棘手的技术障碍。TRAC-CAR的敲入通常使用CRISPR-Cas9系统，而CRISPRoff使用的是dCas9。如果在同一个细胞中同时使用两种基于相同Cas9蛋白的系统，它们所对应的向导RNA (guide RNA) 可能会发生“串扰” (guide swapping)。也就是说，本该引导Cas9去切割TRAC位点的gRNA，可能会错误地与dCas9-CRISPRoff蛋白结合；而本该引导CRISPRoff去沉默RASA2的gRNA，也可能与有活性的Cas9蛋白结合，导致在RASA2基因座上发生意料之外的DNA切割。这种串扰会大大降低编辑效率，并带来新的安全风险。
为了解决这个问题，研究人员巧妙地采用了一种“正交系统” (orthogonal system)策略。他们保留了基于化脓链球菌dCas9的CRISPRoff系统用于沉默RASA2，同时，为CAR的敲入选择了一位“外援”，来自另一种细菌 (Acidaminococcus sp.) 的Cas12a蛋白。Cas12a与Cas9在结构和识别机制上完全不同，它们各自的gRNA互不兼容，从而从根本上杜绝了“串扰”的可能。
实验流程是这样的：他们将用于TRAC-CAR敲入的Cas12a-RNP复合物，与用于沉默RASA2的CRISPRoff mRNA及gRNA混合，一次性电穿孔导入T细胞，随后加入携带CAR基因和同源臂的AAV病毒载体作为修复模板。
结果表明，这一整合策略取得了巨大成功。CRISPRoff的加入丝毫没有影响CAR基因的敲入效率，同时，RASA2蛋白的表达被成功地沉默了。他们成功地在一次操作中，同时完成了对T细胞的“硬件”升级和“软件”优化。
那么，这些经过“软硬兼施”改造的“终极版”CAR-T细胞，其战斗力究竟有多强？
首先，在体外进行了一场残酷的“车轮战”，重复刺激实验。研究人员将CAR-T细胞与表达CD19的肿瘤细胞以不同的比例混合，每48小时重新加入一批新的肿瘤细胞，模拟CAR-T在体内持续遭遇敌人的情景。
实验结果显示，普通的CAR-T细胞（对照组）在经历了前两轮的有效杀伤后，开始显现疲态，杀伤能力逐渐下降，到第五轮时已基本无力控制肿瘤的生长。而经过RASA2沉默优化的CAR-T细胞，则展现出惊人的持久战斗力。从始至终，它们都保持着高效的杀伤活性，一轮又一轮地清除着肿瘤细胞，丝毫不见疲惫。
体外实验的胜利最终还需要在更复杂的体内环境中得到验证。研究人员建立了白血病小鼠模型，给小鼠注射了Nalm6肿瘤细胞，然后分别输注了经过RASA2沉默优化的CAR-T细胞、普通CAR-T细胞，或是不表达CAR的T细胞。
在接下来的40天里，通过活体生物发光成像 (bioluminescence imaging, BLI) 追踪肿瘤负荷的变化，一幅清晰的战局图呈现在眼前。接受了RASA2沉默CAR-T治疗的小鼠，体内的肿瘤被迅速清除，并且在很长一段时间内没有复发。而接受普通CAR-T治疗的小鼠，虽然初期也能控制肿瘤，但很快就出现了肿瘤的复燃和扩散。生存曲线的对比更是有力地说明了问题：RASA2沉默组的小鼠生存期被极大地延长，展现出显著的治疗优势。
这一系列的实验，完美地展示了整合基因与表观遗传编程的巨大威力。它不仅证明了技术上的可行性，更在临床前模型中验证了其带来的实实在在的功能增益。这为未来开发更高效、更持久的CAR-T疗法，特别是用于挑战巨大的实体瘤治疗，打开了全新的想象空间。
这项发表于《自然·生物技术》的研究，不仅仅是给我们带来了一套新颖的基因编辑工具，它更像是在宣告一个细胞编程新纪元的到来。研究人员通过精心的优化和巧妙的设计，构建了一个全RNA的表观遗传编辑平台，实现了对原代人类T细胞功能前所未有的精准调控。
回顾这项工作的核心突破，我们可以看到一幅清晰的蓝图：
首先，安全性与持久性的兼得。CRISPRoff技术在不制造任何DNA断裂的前提下，实现了媲美基因敲除的持久沉默效果。这从根本上规避了传统基因编辑的遗传毒性风险，尤其是在需要多重编辑的复杂应用场景中，其安全性优势无可比拟。
其次，编程的广度与深度。该平台不仅能“关闭”基因 (CRISPRoff)，还能“开启”基因 (CRISPRon)。更重要的是，研究人员展示了超越启动子区域的、对增强子等远端调控元件的精准操作能力。这标志着我们对细胞的编程，正在从简单的“开关基因”，迈向更深层次的“重塑基因调控网络”。
最后，遗传与表观遗传的融合。将精准的基因敲入与功能性的表观遗传沉默无缝整合，创造出性能更优越的CAR-T细胞，这不仅是一次成功的技术演示，更为未来细胞疗法的设计提供了全新的“模块化”思路。我们可以根据不同的疾病需求，像搭积木一样，自由组合不同的基因“硬件”和表观遗传“软件”，定制出最优的细胞产品。
当然，正如研究中所揭示的，前方的道路依然充满探索。例如，CRISPRoff在不同基因座上的效果差异，提示我们对于基因组“非典型”区域的表观遗传调控规律，仍需更深入的研究。但这恰恰是科学进步的魅力所在，每一个未解之谜，都是下一个重大发现的起点。
从“剪切与粘贴”到“编程与调控”，这不仅仅是技术的演进，更是我们理解和改造生命能力的飞跃。我们正在学习使用更接近生命本质的语言，表观遗传密码，来与细胞对话，引导它们成为我们对抗疾病的强大盟友。这项工作为我们描绘的未来，是一个细胞疗法可以被更安全、更精细、更智能地设计和制造的未来。我们有理由相信，这幅宏伟的蓝图，将在不远的将来，转化为治愈更多疾病的强大现实。
参考文献
Goudy L, Ha A, Borah AA, Umhoefer JM, Chow L, Tran C, Winters A, Talbot A, Hernandez R, Li Z, Subramanya S, Arab A, Kale N, Lee JHJ, Muldoon JJ, Liu C, Schmidt R, Santangelo P, Carnevale J, Eyquem J, Shy BR, Marson A, Gilbert LA. Integrated epigenetic and genetic programming of primary human T cells. Nat Biotechnol. 2025 Oct 21. doi: 10.1038/s41587-025-02856-w. Epub ahead of print. PMID: 41120666.
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来源：生物探索一点号1
