摘要：胞嘧啶核糖核苷（胞苷，Cytidine）是 RNA 的核心组分，其是一种关键的化学中间体，用于生产抗病毒药物、抗肿瘤药物、可用作神经保护和增强记忆力的膳食补充剂等。目前胞苷的生产主要依靠化学合成和生物催化定向合成，产量低、不可持续、环境污染严重，不利于绿色发展

胞嘧啶核糖核苷（胞苷，Cytidine）是 RNA 的核心组分，其是一种关键的化学中间体，用于生产抗病毒药物、抗肿瘤药物、可用作神经保护和增强记忆力的膳食补充剂等。目前胞苷的生产主要依靠化学合成和生物催化定向合成，产量低、不可持续、环境污染严重，不利于绿色发展；微生物发酵法因其绿色、可持续、环境友好等特点，成为一种有前景的选择。

目前，已有许多菌株用于胞苷的生产，如大肠杆菌的代谢工程或突变菌株、枯草芽孢杆菌等。其中，枯草芽孢杆菌作为食品安全菌，具有清晰的遗传背景、完备的基因操作工具和完善的代谢调控手段，并因其多样化的碳源利用能力等优势被广泛应用于嘧啶核苷及其衍生物生产菌株的构建。

近日，宁夏大学刘慧燕、方海田团队提出模块化代谢工程策略，系统性改造枯草芽孢杆菌 168（Bacillus subtilis 168）的代谢网络，通过优化以下四个关键模块提高了胞苷的产量：嘧啶核苷的从头合成、中心碳代谢、谷氨酰胺和天冬氨酸的合成、磷酸戊糖途径。最终菌株 B.subtilis BSNX15 采用 5 L 发酵罐中的补料分批培养，胞苷滴度达到 31.41 g/L。该成果以“Multivariate Modular Metabolic Engineering for the Enhanced Biosynthesis of Cytidine in Bacillus subtilis”为题发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上。

第一，优化嘧啶核苷从头合成途径。研究团队首先针对胞苷易降解的特性，敲除编码胞苷脱氨酶（由 Cdd 编码）和胞苷激酶（由 Udk 编码）的基因，阻断胞苷向尿苷及单磷酸胞苷的转化。获得的枯草芽孢杆菌突变株 BSNX2 的胞苷产量达到初始菌株的 10.67 倍，且细胞生长未受显著影响。其次，消除下游操纵子转录的抑制也是构建改变代谢途径的基因工程菌株的有效策略。通过敲除转录抑制因子 pyrR 基因并引入强启动子 P43 增强 pyr 操纵子基因的表达，推动胞苷滴度提升至 0.88 g/L。这一阶段验证了代谢途径去抑制与基因表达强化的协同效应。

图 | 模块化代谢工程实现胞苷的高效生产

第二，重塑中心碳代谢促进胞苷合成。CcpA 是一种被广泛研究的分解代谢控制蛋白，是主要的转录调节因子之一，负责协调中枢代谢，特别是碳的运输和利用、TCA 循环、呼吸作用和次级代谢。因此，CcpA 的修饰可以触发中心碳代谢网络的重编程，并显著改变整体的中心碳代谢。在本研究中，团队发现全局调控因子 CcpA 的敲除（菌株 BSNX5）导致胞苷产量意外下降至 0.51 g/L。

转录组分析表明，CcpA 缺失引发磷酸转移酶系统（PTS）、糖酵解及磷酸戊糖（PP）途径基因表达下调，同时三羧酸循环（TCA）相关基因上调。该结果表明 CcpA 对碳代谢网络的多层次调控具有不可预测性，直接干预全局调控可能破坏代谢平衡。团队由此转向定向优化前体供应，通过阻断竞争通路与强化合成模块提升代谢通量。

第三，增强天冬氨酸和谷氨酰胺合成模块，胞苷合成需要天冬氨酸和谷氨酰胺作为前体。通过删除高丝氨酸脱氢酶（由 hom 编码）来阻断天冬氨酸代谢为L-高丝氨酸，并进一步将天冬氨酸转氨酶编码基因 aspB 的天然启动子替换为强组成型启动子 P43，以增加草酰乙酸到天冬氨酸的合成通量。得到的菌株 BSNX9 胞苷产量提高至 2.71 g/L；谷氨酰胺作为嘧啶核苷从头合成的关键前体，主要由谷氨酸合酶（由 gltA / B 编码）和谷氨酰胺合成酶（由 glnA 编码）通过 TCA 循环中间体α-酮戊二酸生成。将 BSNX9 中 gltA/B 基因的天然启动子替换为 P43 启动子，获得突变菌株 BSNX10。摇瓶发酵后，BSNX10 的胞苷滴度达到 3.83 g/L。

图 | 谷氨酰胺与天冬氨酸通量增强对胞苷合成的影响

第四，增强 PP 途径合成通量。磷酸戊糖（PP）途径作为胞苷前体 PRPP 的核心来源，其代谢通量提升成为后续攻关重点。团队采用“阻断支路+增强主干”策略：敲除嘌呤合成基因 purF 与组氨酸合成基因 histG，减少 PRPP 向竞争途径的流失；随后依次过表达核糖磷酸焦磷酸激酶（Prs）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GndA）及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Zwf）编码基因，使 PRPP 水平从 18.7 mM 升至 32.24 mM，NADPH 含量增加至 203 nmol/g 。最终菌株 BSNX15 在摇瓶中的胞苷产量达 7.03 g/L，较初始菌株提升 234 倍，且细胞生长未受显著抑制，证明代谢负荷控制得当。

为验证工业化潜力，团队在 5 L 发酵罐中采用补料分批发酵策略，通过实时调控葡萄糖浓度、溶氧水平及 pH 值，使工程菌 BSNX15 在 48 小时内实现胞苷产量 31.41 g/L，生产率达 0.65 g/L/h，产量较摇瓶提升 4.47 倍。代谢通量分析表明，放大过程中 PP 途径通量进一步提升，且副产物积累显著低于摇瓶体系，凸显了规模化工艺对代谢网络的优化效应。

该研究的创新性在于将模块化工程策略系统应用于枯草芽孢杆菌的代谢重构，通过降解途径阻断锁定目标产物，解除合成抑制释放酶活潜力，定向优化前体与能量供应提升通量，最终借助工艺放大实现产量提升。相较于传统单点改造，模块化设计兼顾了代谢网络的复杂性与鲁棒性，为微生物细胞工厂的理性构建提供了新思路。未来，结合转录组学与代谢通量分析的多组学整合策略，有望进一步解析模块间相互作用机制，推动合成生物学从“试错式”改造向“可预测性”设计的跨越。

参考链接：

1.Zhang X, Liu L, Niu P, Ye T, Ding W, Wei X, Xu J, Fang H, Liu H. Promoting cytidine biosynthesis by modulating pyrimidine metabolism and carbon metabolic regulatory networks in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2025 May 13;24(1):103. doi: 10.1186/s12934-025-02731-y. PMID: 40355953.

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来源：生辉SciPhi