摘要：显微镜为探索细胞与分子奥秘提供了独特而强大的工具，使科研人员能够在时空尺度上动态解析生命过程。近年来，光强衍射层析（Intensity Diffraction Tomography, IDT）作为一种新兴的无标记三维显微技术逐渐受到关注。它依靠样品固有折射率分

导读

显微镜为探索细胞与分子奥秘提供了独特而强大的工具，使科研人员能够在时空尺度上动态解析生命过程。近年来，光强衍射层析（Intensity Diffraction Tomography, IDT）作为一种新兴的无标记三维显微技术逐渐受到关注。它依靠样品固有折射率分布进行成像，避免了荧光标记引起的光损伤，尤其适合长期活细胞成像1。当与三维荧光显微技术结合时，多模态成像策略能够同时提供分子特异性与整体结构信息，为揭示细胞成分和相互作用提供了系统可靠的成像手段2。然而，长期（数小时至数天）的三维成像常常受到细胞光学异质性、环境热漂移及成像系统机械不稳定性的影响，导致时变像差与焦点漂移3。如何实现亚细胞结构的长期追踪和多模态成像的精确共定位，已成为亟待解决的关键难题。

针对这一问题，南京理工大学陈钱、左超教授课题组联合西安电子科技大学郜鹏教授课题组，提出了自适应光学辅助的三维多模态成像方法（简称AO-FIDT）。该方法在傅里叶叠层衍射层析的理论框架下引入了时变像差更新模型，可从捕获的无标记强度图像中同时重建IDT结果和时变像差。与此同时，荧光模块将实时计算的像差解反馈至系统的点扩散函数中，以获得自适应光学辅助校正后的三维荧光结果。实验表明，AO-FIDT在成像易受光毒性影响的细胞与生命过程（如有丝分裂）中展现出独特优势。相关成果以 “Adaptive Optics-Assisted Long-Term 3D Fluorescence and Intensity Diffraction Tomography for High Spatiotemporal Resolution Cellular Imaging”为题发表在 Laser & Photonics Reviews期刊，并被选为2025年8月封面论文。博士生周宁、博士后张润南、硕士生朱睿智为论文共同一作，郜鹏教授、孙佳嵩教授及左超教授为论文通讯作者。

当前，长期（数小时至数天）的三维显微成像面临根本性挑战：细胞的光学异质性、环境热波动以及显微镜结构的机械不稳定性，均可能导致时变像差和焦点漂移。虽然在三维光学显微成像中，焦平面与离焦平面的传统界限已逐渐模糊，即便离焦，细胞结构等关键信息仍可在重建的其他层中呈现。然而，焦点漂移仍会严重干扰亚细胞细胞器的长期追踪与观察，并影响双模态成像中轴向共定位的精确性，成为制约长期成像的关键瓶颈。

为保证活细胞在长期观测周期内获得稳定且高质量的成像结果，研究人员尝试采用多种补偿策略。例如，利用显微镜的 z 轴漂移补偿器维持聚焦4，可支持较高精度和快速的细胞分析。但此类机械补偿仅能消除离焦像差，无法抑制高阶像差对成像质量的影响。近年来，计算自适应光学（AO）方法被提出，通过算法校正成像系统的时变像差，从而避免额外硬件补偿。然而，目前此类方法多局限于二维定量相位成像，尚未实现三维条件下亚细胞结构的长期追踪及多模态成像中的精确共定位5。因此，亟需发展新的原理与方法来突破这一限制。

为解决三维条件下亚细胞结构的长期追踪及多模态成像中精确共定位的难题，本研究提出了自适应光学辅助的三维荧光-光强衍射层析多模态成像方法（AO-FIDT）。如图1(a)所示，该方法在傅里叶叠层框架下引入 AO 辅助的 IDT 模块，并推导出时变像差更新模型，可从无标记强度图像中同时分离三维折射率分布和像差。荧光模块将计算得到的像差解实时反馈至点扩散函数中，并结合三维 Richardson–Lucy 算法获得 AO 校正后的三维荧光结果（图1b）。在成像性能方面，借助环形数值孔径匹配的照明配置，IDT 模块在7.5 volumes/s（160×160×30 μm3）下实现了 175 nm 横向分辨率和 775 nm 轴向分辨率，荧光模块通过轴向扫描获取的图像堆栈则进一步用于辅助 IDT 对细胞结构的解析。

图1： AO-FIDT 实验装置和图像重建流程图

为验证所提方法的有效性与必要性，我们模拟了存在环境热波动的成像场景，并利用 AO 辅助方法校正时变像差引起的焦点漂移。实验中，将 HeLa 活细胞培养皿从培养箱取出并置于显微镜载物台上，培养基温度在 30 分钟内由 37.5 ℃ 降至室温 26 ℃，细胞逐渐进入凋亡过程。视频1 展示了 HeLa 细胞重建结果的全视场切片，其中线粒体、细胞边界、脂滴和丝状伪足（白色箭头）等亚细胞结构均实现了高分辨率可视化。进一步对比有无 AO 辅助的动态成像结果可见：未使用 AO 时，同一 z 平面的细胞信息随时间显著波动，主要由于时变散焦像差所致；而在 AO 辅助下，成像稳定性显著提升，凋亡过程被清晰捕捉。在 t=18:05，细胞明显收缩，丝状伪足向中心收拢，对比度增强；至 t=29:10，细胞逐渐变圆并附着于玻璃基底，部分伪足尖端仍保留在原始位置。该结果证明 AO-FIDT 方法能够有效提升 z 轴重建的亚细胞器分布稳定性，同时保持近衍射极限的横向分辨率。

AO-FIDT 方法结合了衍射层析与荧光成像的优势，兼具卓越的时空分辨率和分子特异性。为验证其综合性能与实用性，我们在 COS-7 活细胞上开展了双模态共定位实验，并使用 MitoTracker Red 对线粒体进行荧光标记。视频2 展示了 COS-7 细胞有丝分裂过程的双模态动态成像结果：在 IDT 重建结果中呈现的蠕虫状、弯曲和扭曲的亚细胞器与 MitoTracker Red 荧光信号完全重叠，证实其为线粒体。实验中，IDT 以 7.5 Hz 的速率连续成像，并每隔 1 小时获取一次双模态共定位结果。尽管环境热波动与机械不稳定性导致系统出现显著时变像差，AO-FIDT 依然能够在长时程内稳定跟踪细胞器运动和形态变化，实现 IDT 与荧光结果在三维轴向上的精确共定位。值得注意的是，与线粒体在荧光成像中高度敏感于光毒性和光漂白相比，无标记的三维IDT成像在长时程观测中不影响细胞分裂的正常进程。结果表明，AO 辅助的无标记IDT成像能够在全视场范围内实现高时空分辨率的连续成像，使稀有结构和中间体得以可视化；结合 3D 荧光标记，还可进一步揭示亚细胞结构在不同时间和空间尺度下的身份与动态，从而加速生命科学研究的进展。

总结与展望

在本研究中，研究团队提出了一种新颖的 AO-FIDT 方法，并搭建了相应实验装置。该方法将 AO 辅助像差校正与 IDT 集成，基于迭代叠层算法，可从无标记强度图像中有效分离出耦合的三维 IDT 结果与像差。同时，实时计算的像差解被反馈至点扩散函数中，以同步校正三维荧光结果，从而显著提升荧光模态的重建质量。HeLa 细胞凋亡实验表明，AO-FIDT 能有效克服时变像差和机械误差引起的焦点漂移，在不牺牲成像速度和分辨率的前提下，显著增强长期活细胞成像性能。进一步地，结合分子特异性的标准荧光成像模式，AO-FIDT 为原本只能独立研究的生物成分与相互作用提供了统一的协同分析平台。COS-7 细胞的长期双模态实验结果进一步证明，该方法可在高时空分辨率下稳定成像线粒体等亚细胞器的形态与动态。据我们所知，这是 AO 技术首次应用于三维双模态成像，实现了长期、高时空分辨率的三维细胞成像，凸显了 AO-FIDT 作为一种非侵入性成像工具，在细胞及亚细胞尺度研究中展现出的重大潜力。

来源：博识雅士