摘要：该研究提供了一种无需外源转录因子、通过定向分化方案，从人诱导多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞中衍生出甲状腺滤泡上皮细胞（TFC）的方法，该方法重现了甲状腺发育过程中的关键发育阶段。

该研究提供了一种无需外源转录因子、通过定向分化方案，从人诱导多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞中衍生出甲状腺滤泡上皮细胞（TFC）的方法，该方法重现了甲状腺发育过程中的关键发育阶段。

该研究描述了一个方案：首先接种iPSC，诱导定型内胚层和前肠内胚层，随后通过成纤维细胞生长因子/骨形态发生蛋白（FGF/BMP）信号通路进行甲状腺谱系特化，最终分化并成熟为甲状腺滤泡细胞。

该方案已使用来自多种人类遗传背景的干细胞系进行了验证。

文章介绍

题目：人诱导多能干细胞定向分化为甲状腺滤泡上皮细胞的方案

杂志：STAR Protocols

影响因子：1.3

发表时间：2025年9月

#1

研究关键

Research Keywords

从人iPSC中分化出甲状腺滤泡细胞的实验方案；

体外甲状腺谱系定向分化、发育与成熟的逐步操作流程；

通过酶消化法制备类器官单细胞悬液的指导说明；

确保体外甲状腺滤泡细胞的质量控制。

实验方案示意图

#2

实验步骤

Experimental Procedure

（一）准备部分详情

2D基质胶包被培养板的操作 ● 时间 45‒60 min

在人iPSC或胚胎干细胞（ESC）的维持培养以及定型内胚层诱导步骤中，细胞将在2D基质胶包被的培养板上进行培养。

由于基质胶在冰上保存时呈液态，在温度高于4℃时会凝固，因此必须将基质胶储备液和包被液始终保存在冰上，并且用于处理基质胶的血清移液管和移液器吸头需预先在冰冷（4℃）的PBS或DMEM/F12培养基中冷却。

不同批号的基质胶用于包被培养板所需的准确体积可能有所不同。建议将基质胶在冰上解冻，并按建议的体积分装，该体积为包被2块完整的6孔板所需（各批次号的具体说明书会提供包被4块板所需的体积）。

1. 在冰上解冻2D基质胶分装液。

2. 配制基质胶包被液：

a. 将12 mL DMEM/F12培养基转移至一个Falcon管中，保持在冰上以维持低温。

b. 将移液枪头预先在冰冷的PBS中冷却。

c. 向冰冷的DMEM/F12中加入1管足以用于两个完整6孔板的基质胶，倒置混匀。

3. 向两个6孔板的每个孔中加入1 mL基质胶包被液：

a. 通过上下吸取5次冰冷的PBS来预冷血清学移液管。

b. 将1 mL包被液转移至每个孔中。

c. 轻轻摇晃或倾斜培养板，确保每个孔的底部完全被包被液覆盖。

4. 将培养板放入37℃、5% CO₂的培养箱中孵育20 min，使基质胶凝固。

5. 使用前，去除包被液，并用1 mL DMEM/F12清洗各孔。

6. 多余的包被板可在4℃下保存最多10天：

a. 为确保每个孔始终完全被包被液覆盖，向每个孔中加入100 μL DMEM/F12，以防止因蒸发导致体积减少。

b. 用封口膜密封培养板，并储存在4℃。

c. 使用前，必须将培养板再次在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育20 min。

将人iPSC解冻并接种至基质胶包被的培养皿上 ● 时间 45 min

人多能干细胞冻存管在解冻时应遵循尽量减少单细胞分散、促进细胞团块维持的原则。本方案既适用于ESC的分化，也适用于iPSC的分化。为表述简洁，下文步骤将仅以人iPSC为例进行说明。为提高细胞解冻后的存活率，将在最初24 h内添加ROCK抑制剂以防止细胞凋亡。

配制含ROCK抑制剂的mTeSR培养基（最终抑制剂浓度为10 μM）。

7. 配制2.5 mL的mTeSR培养基+10 μM ROCK抑制剂。

8. 从新包被的6孔板中取出一孔，去除多余的基质胶：

a. 用1 mL DMEM/F12清洗每个孔。

b. 吸去DMEM/F12，加入1 mL含10 μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基。

c. 将培养板放入培养箱中。

9. 将一管iPSC冻存管从-150℃冰箱中取出，放在干冰上，转移至细胞培养室。

10. 在37℃水浴中快速解冻冻存管，期间轻轻摇动冻存管，直至仅剩少量冷冻小块（或者使用自动冻存管解冻设备进行解冻）。

11. 用喷有70%乙醇的Kimwipes擦拭冻存管，然后将其放入生物安全柜中。

12. 使用5 mL血清学移液管将细胞转移至50 mL锥形离心管中。

13. 在轻轻旋转离心管的同时，逐滴加入5 mL mTeSR培养基至细胞中。

14. 在20℃‒24℃下以200 rcf离心细胞5 min。

a. 吸弃上清液。

b. 向细胞沉淀中加入1 mL含10 μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基。

c. 轻轻弹击离心管以重悬细胞。

d. 使用5 mL血清学移液管将细胞团块转移至新包被基质胶的孔中，同时加入1 mL含10 μM ROCK抑制剂的mTeSR培养基，使总体积达到2 mL。

15. 将细胞均匀分布在孔中，并将培养板放入培养箱中。

▲注意：培养基应每24 h更换一次。

▲关键 在解冻过程中，iPSC/ESC因脱离基质而极易发生凋亡。ROCK抑制剂可防止解离诱导的细胞死亡，提高细胞存活率和贴壁效率。

人iPSC未分化状态的维持 ● 时间 10‒15 min

配制mTeSR培养基

16. 每天使用显微镜检查细胞融合度及自发分化情况。

a. 标记培养皿底部自发分化细胞的区域（图S1）。

b. 使用移液器吸头（P1000）将分化的细胞从培养皿上刮除。

17. 更换培养基。

a. 吸去培养上清液。

b. 用2 mL PBS清洗细胞。

c. 向每个培养孔中加入2 mL mTeSR培养基。

18. 在37℃、5% CO₂的条件下孵育。

▲关键：培养基应每24 h更换一次。当细胞融合度达到80%时，传代培养iPSC或开始定向分化。传代比例需根据具体的细胞系进行优化，建议初始传代比例为1:12，然后在该比例范围1:6至1:30内进行调整，目标是使细胞在6‒8天内达到80%的融合度。

图S1 iPSC的代表性图像附近分化细胞。黑色箭头表示在iPSC边缘的细胞区分细胞。比例尺：200 µm。

（二）分步操作方法详情

定形内胚层分化 ● 时间 3天；第-1天、第0天和第1天

第-1天：将iPSC以单细胞形式接种

检查细胞达到最佳汇合度（约80%），并去除任何自发分化的细胞（图S1）。

准备含ROCK抑制剂（终浓度为10 μM）的mTeSR培养基。准备已用2D基质胶包被的培养板。

1. 将细胞解离成单细胞悬液，使用mTeSR+10 μM ROCK抑制剂。

a. 用2 mL PBS清洗细胞。

b. 在20℃‒24℃下，用1 mL温和细胞解离试剂孵育6‒10 min。

c. 吸去温和细胞解离试剂。

d. 轻轻吹打细胞，将细胞从培养皿上吹起，并在1 mL mTeSR+10 μM ROCK抑制剂中通过上下吹打8‒10次，使细胞解离成单细胞状态。

e. 将细胞悬液转移至离心管中。

f. 在4℃下以300 rcf离心细胞5 min。

2. 将iPSC以单细胞形式进行计数与接种

a. 目标接种密度：每孔（6孔板）1.5–2×10⁶个活细胞。

b. 用足量的mTeSR培养基（含10 μM ROCK抑制剂）重悬细胞沉淀，以达到所需的接种密度。

c. 将细胞转移至已包被2D基质胶的培养板上。

d. 在37℃、5% CO₂条件下孵育16–24 h。在继续进行定型内胚层诱导之前，细胞应达到超过95%的汇合度。

▲关键：在第-1天以足够高的密度接种细胞至关重要，推荐每孔接种200万个活细胞，并确保每个孔在第0天结束时（总分化天数=1）达到完全汇合。第0天接近100%的汇合度对于后续阶段中保持一致且可靠的分化至关重要。

▲注意：这是本方案中可灵活调整的最后一步。虽然在此步骤中可以适当微调接种密度和汇合度，但后续3天（第0天、第1天和第2天）的孵育时间必须严格遵循，以确保分化成功。

▲注意：从多能性向定型内胚层转变的过程中，涉及显著的细胞骨架重塑。Y-27632可增强细胞存活率，有助于更好的细胞间黏附及提高分化效率。

第0天：定型内胚层诱导

准备StemDiff基础培养基（每孔2 mL）+补充剂MR+补充剂CJ（表1；100×储备液，最终浓度为1×）。

3. 更换培养基。

a. 用2 mL PBS清洗细胞。

b. 向每个孔中加入2 mL基础培养基+补充剂MR和CJ。

4. 在37℃、5% CO₂条件下孵育24 h（±1 h）。

▲关键：在这最初24 h使用基础培养基+补充剂MR和CJ后细胞的存活情况，是分化是否成功的关键指标。因此，在进行第1天的下一步操作之前，评估细胞汇合度非常重要。

第1天：定型内胚层诱导

配制StemDiff基础培养基（每孔2 mL）+补充剂CJ（表2；100倍储备液，终浓度为1倍）。

5. 更换培养基。

a. 用2 mL PBS清洗细胞。

b. 向每个孔中加入2 mL基础培养基+补充剂CJ。

6. 在37℃、5% CO₂条件下孵育24 h（±1 h）。

在3D基质胶基质中向原始前肠内胚层分化 ● 时间 2天；第2天至第3天

制备cSFDM培养基（表3）和前化培养基（表4；每孔0.8 mL[24孔板]）。

解冻3D基质胶（康宁基质胶低生长因子基底膜基质，无酚红），操作全程置于冰上，并将移液枪头预先在冰冷的PBS中预冷，因为3D基质胶在超过+4℃时会发生凝固。

建议使用Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）收获细胞，该培养基是cSFDM的主要成分，有助于温和地将细胞过渡到新培养基中。在前48 h内将加入ROCK抑制剂（终浓度为10 μM），以防止因手动操作（如挑取和将细胞包埋入3D基质胶中）以及因培养条件变化而引起的细胞死亡。

7. 将细胞以细胞片形式解离，用于3D基质胶包埋。

a. 用2 mL PBS清洗。

b. 在20℃‒24℃下，用1 mL温和细胞解离试剂孵育4‒5 min。

c. 吸除温和细胞解离试剂。

d. 使用细胞刮刀将细胞刮入1 mL IMDM培养基中。

e. 将细胞悬液转移至离心管中。

f. 在4℃、300 rcf条件下离心细胞5 min。

8. 细胞计数及将细胞包埋于3D基质胶中。

a. 目标接种密度约为每60 μL基质胶圆顶150,000个细胞（即2500个细胞/μL）。

b. 吸除细胞沉淀上方大部分培养基。

c. 轻轻弹击离心管，使沉淀在剩余培养基中松散。

d. 将细胞重悬于3D基质胶中。

e. 将60 μL含有细胞的3D基质胶以圆顶状转移至24孔板每个孔的中心。

f. 在37℃、5% CO₂条件下孵育20 min，使3D基质胶固化。

9. 每孔加入800 μL前体化培养基，在37℃、5% CO₂条件下孵育2天。

甲状腺分化（使用ROCK抑制剂启动） ● 时间 2天；第4天至第5天

准备分化培养基（表5；每孔0.8 mL [24孔板]）+ROCK抑制剂（终浓度10 μM）。

在鉴定过程中，培养基将每两天更换一次。

10. 更换培养基。

a. 用1 mL PBS清洗细胞。

b. 向每个孔中加入0.8 mL鉴定用培养基+10 μM ROCK抑制剂（培养基将每两天更换一次）。

11. 在37℃、5% CO₂条件下孵育2天。

甲状腺分化诱导 ● 时间 8天；第6天至第13天

制备分化诱导培养基（表5；每孔0.8 mL [24孔板]）。

在分化诱导过程中，每两天更换一次培养基，共更换4次。

12. 更换培养基

a. 吸出培养基，注意不要破坏基质胶形成的穹顶结构。

b. 每孔加入0.8 mL分化诱导培养基（培养基将每两天更换一次）。

13. 在37℃、5% CO₂条件下孵育2天。

▲关键：在甲状腺分化诱导过程中，通过显微镜观察细胞形态是一种快速且无创的质量控制方法。因此建议每2‒3天使用相差显微镜观察细胞，并记录与预期类器官形态相比异常结构的存在及其比例。

甲状腺分化（使用ROCK抑制剂） ● 时间 第14天至第15天，共2天

准备分化培养基（表6；每孔0.8 mL [24孔板]）+ROCK抑制剂（终浓度为10 μM）。

在分化和成熟过程中，培养基将每两天更换一次。

14. 更换培养基。

a. 用1 mL PBS清洗细胞。

b. 向每个孔中加入0.8 mL分化培养基+10 μM ROCK抑制剂（培养基将每两天更换一次）。

15. 在37℃、5% CO₂条件下孵育2天。

▲关键：在甲状腺滤泡形成过程中，ROCK抑制有助于防止细胞凋亡。

甲状腺分化和成熟 ● 时间 第14天及以后；从第16天开始

准备分化培养基（表6；每孔0.8 mL [24孔板]）。

在分化和成熟过程中，培养基将每两天更换一次。

16. 更换培养基。

a. 吸出培养基，但不要破坏基质胶形成的穹顶结构。

b. 每孔加入0.8 mL分化培养基（培养基将每两天更换一次）。

17. 在37℃、5% CO₂条件下孵育2天。

▲关键：随着成熟过程的推进，根据培养基颜色在48 h内发生的变化所指示的pH变化，需要将培养基体积调整至1-1.2 mL，或者将培养基更换频率增加到每天一次。如果培养基中的pH指示剂在48 h内变为黄色，建议将每孔的培养基体积增加至最多1.2 mL。如果培养基颜色在48 h内仍然变黄，则应将培养基更换频率调整为每24 h一次。

▲注意：所有关键的储备溶液均列于表7中，包括其稀释液、储备浓度和最终浓度以及储存条件。

通过酶解类器官制备用于细胞分选的单细胞悬液 ● 时间 2 h

为进行流式细胞术分析或细胞分选，需将3D基质胶中的细胞解离为单细胞悬液。该步骤包括溶解基质胶（通常采用酶处理或专用回收溶液），释放包裹的类器官；随后通过胰酶消化进一步解离类器官以获得单细胞。之后清洗细胞、离心并过滤去除碎片，最终获得适用于分选或后续实验的单细胞悬液。此步骤对确保细胞纯度、活性及功能完整性至关重要，直接影响后续实验效果。

配制FACS缓冲液（含2% ES胎牛血清的PBS）：混合49 mL PBS与1 mL ES胎牛血清，添加终浓度为10 μM的ROCK抑制剂。

对于培养时间

对于培养时间>35天的类器官，配制含2 mg/mL Dispase+0.2 mg/mL Ⅳ型胶原酶的IMDM培养基溶液。

18. 3D基质胶酶解与类器官回收

a. 吸弃原有培养基，每孔加入0.8 mL Dispase溶液（或Dispase+胶原酶IV混合溶液）。

b. 37℃孵育15 min。

c. 使用P1000移液器上下吹打3次，破坏基质胶穹顶结构。

d. 继续37℃孵育15 min。

e. 将含细胞的酶解液转移至离心管，20℃‒24℃条件下以300 rcf离心5 min。

19. 将类器官解离为单细胞悬液。

a. 吸去上清液，轻轻将细胞重悬于1 mL胰酶溶液（0.25%）中。

b. 将试管在37℃水浴中剧烈振荡1 min。

c. 将细胞置于冰上冷却1 min。

d. 加入1 mL ES-FBS，通过振荡混匀。

e. 加入10 mL IMDM，以300 rcf离心5 min，温度为20℃‒24℃。

20. 用PBS清洗细胞。

a. 使用P1000移液器上下吹打5次，将沉淀重悬于1 mL PBS中。这也有助于进一步解离细胞，获得单细胞悬液。

b. 再加入1 mL PBS，通过振荡混匀。

c. （可选）在此步骤中进行细胞计数，这可以作为类器官已解离为单细胞状态的对照。

d. （可选）继续进行染色流程。

21. 过滤重悬于FACS缓冲液中的细胞。

a. 吸去上清液，将细胞重悬于0.5‒1 mL FACS缓冲液中。

b. 加入活/死染料（每1 mL缓冲液加入1 μL Calcein blue）。

c. 将细胞悬液通过FACS管上的35 μm细胞滤网盖推过，以去除任何残留的细胞团块。

d. 在细胞分选前，将细胞置于冰上并避光保存。

▲关键：为确认细胞悬液由单细胞组成，整个工作流程中整合了多个验证步骤。过滤前，细胞计数可初步反映解离效率——若获得高且稳定的细胞产量，则表明单细胞生成效果良好。作为补充建议，推荐对悬液进行简短的显微镜检查，以直观确认存在单个细胞且无可见细胞团。

▲注意：使用带细胞滤网盖的FACS管可确保去除残留聚集体或细胞团块。该步骤对于制备适用于流式细胞术的单细胞悬液至关重要，若样本能顺利通过滤网，通常无需进一步的质量控制。

传代培养iPSC来源的甲状腺类器官 ● 时间 2 h

本步骤是指将iPSC生成的类器官进行分割，以维持其生长或扩大规模用于后续实验。需将成熟的类器官小心地分散成较小的碎片，从而为持续生长提供足够的空间和营养。随后将这些较小的类器官碎片重新接种至新鲜的基质胶中，使其重新建立结构并恢复增殖与分化能力。

预热试剂并确定传代比例：根据待传代孔决定细胞培养传代的稀释比例（即从一个孔传代到多少个孔）。然后相应解冻足量的3D基质胶（如按1:4比例传代：1个直径约60 μL的类器官球体分为4个60 μL的球体→需在冰上至少解冻250 μL的3D基质胶）。

配制2 mg/mL Dispase酶溶液：将100 mg Dispase溶解于50 mL IMDM培养基中，并经无菌过滤处理。

小心操作以减少机械损伤：从3D基质胶中回收细胞时，尽量减少移液操作步骤，以避免将类器官打散。

22. 用1 mL PBS清洗细胞。

a. 吸除培养基，注意不要破坏基质胶穹顶结构，然后向每个孔中加入1 mL PBS。

b. 轻轻倾斜培养板2‒3次以清洗，随后吸除PBS。

23. 消化3D基质胶以回收类器官。

a. 向每个孔中加入800 μL的Dispase（分散酶）溶液。

b. 使用无菌P1000移液枪头小心地破坏3D基质胶穹顶结构，手动“切割”成小块，注意不要吹打。

c. 在37℃下孵育15 min以分解3D基质胶。

d. 将细胞从培养箱中取出，使用P1000移液枪头轻轻搅动基质胶穹顶，缓慢上下吹打3次以破坏基质胶结构。

e. 然后再在37℃下孵育15 min，进一步分解基质胶。

24. 从Dispase溶液中收集类器官。

a. 将细胞从培养箱中取出。为收集所有细胞，使用P1000移液枪头将溶液转移至15 mL的Falcon管中。

b. 在20℃‒24℃下，以300 rcf离心5 min。

25. 用5 mL PBS清洗细胞2次，以去除Dispase。

a. 吸除细胞沉淀上的上清液。

b. 向沉淀中加入5 mL PBS，用移液枪头轻轻搅动细胞沉淀，使类器官重悬于PBS中。尽量避免吹打。

c. 在20℃‒24℃下，以300 rcf离心5 min。

d. 重复步骤25 a‒c，进行第二次清洗。

26. 将类器官重新铺板至3D基质胶中。

a.清洗细胞后，吸去上清液，并将装有细胞的试管置于冰上（放置1 min）。

b.通过轻弹Falcon管使类器官重悬于剩余的PBS中。

c.将细胞重悬于3D基质胶中（请记得使用预冷的移液枪头）。

d.将60 μL含细胞的3D基质胶转移至24孔板的每个孔中。

e.确保将基质胶圆顶置于孔中央，避免产生气泡。

27. 将培养板在37℃、5% CO₂培养箱中孵育20 min，使3D基质胶圆顶固化。

28. 向每个孔中加入800 μL分化培养基，并在37℃、5% CO₂条件下孵育细胞48 h。

▲关键：如果为了解决存活率低的问题需要，可在前24-48 h内添加ROCK抑制剂，但根据经验，这对细胞存活并非至关重要。如果使用报告基因细胞系，在最初2-4天内，单个类器官中的荧光信号可能表现出不均匀性，出现强弱不一的斑点，但通常在一周内会再次趋于均匀。因此建议在传代后的前五天内避免对这些细胞进行任何测试或处理，给予它们足够时间适应并重新组织成完整的类器官。

（三）预期结果

通过观察甲状腺定向分化方案（图1A）实施过程中细胞的形态、基因表达情况，以及（如适用）荧光报告基因的表达情况，细胞/类器官外观及基因表达谱的若干变化可作为评估单次分化是否成功的依据，具体如下。

1. 终末内胚层诱导的预期结果

在使用StemDiff试剂盒进行终末内胚层诱导的过程中，细胞形态预计会发生如下变化：在接种于mTeSR培养基（含ROCK抑制剂）的第0天，细胞呈现略微拉长且带刺状的外观；到内胚层诱导的第2天，细胞形态应转变为更趋近于六边形或圆形（图1B-C）。

细胞在接种后应达到超过95%的汇合度，第1天时汇合度应保持不变或有所增加，并且第2天时细胞数量应有所增加——这主要通过培养基中漂浮的多余细胞来观察。在第2天评估cKIT与CXCR4的共表达时，双阳性细胞的比例应超过55±12%（n=3）。

此阶段的基因表达分析显示，干细胞标志物（如OCT4）的表达下降，而原始条带和内胚层相关基因（如Brachyury、FOXA2、SOX2和SOX17）的表达则有所上升。

图1. 甲状腺滤泡细胞定向分化方案。（A）将人iPSC或ESC分别定向分化为甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡细胞的方案示意图，分化时间分别为第14天和第29‒45天。（B）BU3 NGP8T细胞在甲状腺定向分化过程中不同阶段的明场显微镜图像。（C）BU3 NGP8T细胞在原肠内胚层诱导阶段（第0‒2天）、前化处理后（第4天）以及甲状腺谱系特化末期（第13天）的更高倍数明场显微镜图像。（D）代表性流式细胞图，展示BU3 NGP8T细胞在第14天谱系特化后，及第29和45天分化和成熟过程中NKX2-1GFP与PAX8tdT的表达情况。

2. 定向内胚层前体化的预期结果

在对3D基质胶包埋的定型内胚层（DE）进行48 h双重Smad信号通路抑制后，通过相差显微镜应能观察到具有略带颗粒状核心和平滑边缘的小圆形球体（图1B-C）。虽然预期会看到一些死亡细胞（表现为无纹理的小点）和破碎的细胞团块，但大多数可见结构应为具有平滑边缘的球体。

在第四天进行基因表达谱分析时，与未分化的iPSC相比，FOXA2和SOX2的表达应当升高；而与第二天细胞相比，SOX17和Brachyury的表达则应当降低。

3. 甲状腺分化预期结果

在甲状腺分化结束时，原本边缘光滑的类器官应有所增大，其略带颗粒状的核心可能变得更为扁平且均匀（图1B）。若使用BU3 NGP8T报告细胞系，通过流式细胞术可在第8天左右检测到两种荧光标记物，通过活细胞荧光显微镜观察则大约在第10天可见，并在接下来的4天内逐渐变得更加均匀和明亮（图S2）。

在第14天进行NKX2-1GFP与PAX8tdT共表达的FACS分析时，不同分化实验之间可能会显示出较大差异。如观察到GFP与tdT双阳性细胞的平均效率为36%±20%（n=12；图1D）。

通过相差显微镜观察，可能会看到多种形态各异的细胞团簇，这些团簇未表达NKX2-1GFP和PAX8tdT报告基因，因此并未经历甲状腺谱系的分化。尽管在许多分化实验中除了预期的圆形、边缘光滑的类器官外，也可以观察到这些结构，但在分化效率较低的实验中，它们往往占大多数，相关内容将在下文的故障排除章节中更详细地描述。

至第14天时，基因表达分析通常应显示四种经典的甲状腺转录因子——NKX2-1、PAX8、HHEX和FOXE1的高表达，同时早期内胚层标志物FOXA2和SOX17应不表达或表达极低。

图S2 使用BU3 NGP8T细胞进行定向分化过程中的荧光活细胞成像。图中展示了前肠内胚层前化处理后（上图）、甲状腺分化起始阶段（中图）以及甲状腺分化与成熟阶段（下图）NKX2-1GFP与PAX8tdT报告基因的表达情况（荧光显微镜图像）。

4. 甲状腺成熟的预期结果

在甲状腺分化和成熟的过程中，原本呈圆形、边界光滑的类器官将进一步增大，其形状也会变得更加不规则。与此同时，前述非甲状腺结构（如非甲状腺相关组织）的生长速度会减缓。

使用BU3 NGP8T报告系，在第28‒30天通过FACS染色通常可观察到GFP与tdT双阳性细胞的比例上升至48%±15%（n=10），而到了第43–47天，该双阳性细胞群比例进一步增加至71%±11%（n=10；图1C）。

为通过基因表达评估甲状腺的成熟程度，验证了TG（甲状腺球蛋白）、TPO（甲状腺过氧化物酶）和TSHR（促甲状腺激素受体）的表达是否被诱导上调。

从培养的第30‒35天开始，3D基质胶微球的形态开始发生变化，表面逐渐变得凹凸不平（图2A）。显微镜观察显示，这些区域似乎吸收了更多的光线，这很可能是由于类器官之间形成了细胞外连接结构（图2B、3B）。这种现象在分化成功的情况下往往出现得更早和/或更为显著，尤其是在NKX2-1GFP；PAX8tdT阳性细胞产量较高的分化体系中。

图2 甲状腺滤泡细胞定向分化过程中潜在非理想结果的示例。（A）在24孔板中进行3D培养时，3D基质胶穹顶结构在起始阶段（第2天）与结束阶段（第45天）的宏观表现。（B）3D基质胶穹顶结构在固化后（第2天）、甲状腺类器官成熟过程中（第30天）以及成熟结束时（第45天）的高倍放大图像。（C）在定型内胚层诱导的第0天和第1天，采用相差显微镜观察的细胞图像。上图展示了一个理想结果，细胞持续100%汇合；中图和下图则分别代表非理想的定型内胚层（DE）诱导情况，其中第1天时细胞汇合度出现轻微（中图）至中度（下图）下降。（D）在某些分化实验中，除了观察到边缘光滑的圆形甲状腺类器官（黑色箭头）外，还可见到较大、粗糙且带有凹陷的球体（白色箭头所示）。（E）使用NKX2-1GFP和PAX8tdT报告基因系BU3 NGP8T，在甲状腺特化第11天时，对大而粗糙的球体及其周围边缘光滑的甲状腺类器官进行荧光显微镜观察。（F）在某些分化实验中，通过相差显微镜观察到的不规则、破碎的细胞团块，这些细胞团块有的与光滑的甲状腺类器官分离（左图），有的位于光滑类器官的周边（右图）。白色箭头指示破碎的细胞团块，黑色箭头标记边缘光滑的甲状腺类器官。两个图中框选区域在右侧放大的图像中以更高倍率显示。

图3 iPSC来源甲状腺类器官的传代培养。（A）类器官培养传代的分割方案示意图。（B）左图：未分割细胞与第25天（第1组图）分割过程中细胞的明场显微镜图像，以及第29天（第2组图）和第42天（第3组图）未分割与1:4分割细胞、第60天1:4分割细胞长出的类器官（第4组图）。右图：相应时间点使用NKX2-1GFP与PAX8tdT报告细胞系BU3 NGP8T的活体类器官荧光显微镜图像。（C）第45天BU3 NGP8T细胞的代表性流式细胞术散点图，展示NKX2-1GFP与PAX8tdT表达情况。细胞或连续培养于同一孔中（左图），或在第25天进行1:4分割（右图）。（D）点图展示第45天连续培养（未分割；n = 3）与第25–29天以1:4分割后长出的类器官细胞（1:4分割；n = 11）中GFP⁺;tdT⁺双阳性细胞的比例。

5. 甲状腺类器官分割的预期结果

分割甲状腺类器官可以减缓3D基质胶随时间推移而发生的降解，同时促进细胞的进一步增殖，且不会影响其甲状腺谱系命运（图3）。在约第21‒29天进行分割后，细胞外生长的结果是在第45天时，总GFP⁺；tdT⁺双阳性细胞数量增加了两倍。

显微镜观察显示，在分割后第一周内，分割类器官的外生长体积就超过了未分割的对照组（图3B）。通过FACS（图3C-D）或活细胞显微镜（图3B）检测发现，即使在长时间培养至第60天（即分割后35天）的情况下，分割类器官的甲状腺谱系命运依然保持稳定，表现为NKX2-1 GFP与PAX8 tdT的共表达。

6. 基础与转化研究的预期成果

该方法不仅能够实现甲状腺滤泡上皮细胞稳健且可重复的体外分化，还为研究甲状腺发育的关键阶段（包括谱系决定、模式形成和滤泡发生）提供了强大平台。

虽然目前尚未成功生成具有完全功能、能分泌激素的甲状腺类器官，但该方案是实现这一目标的关键一步。

展望未来，它可能为旨在恢复先天性或术后甲状腺功能减退患者甲状腺功能的再生医学方法奠定基础。此外，生成患者特异性甲状腺组织的潜力为个性化药物筛选和治疗发现开辟了新途径，特别是在治疗抵抗性甲状腺疾病方面。

材料

材料

试剂

数据

参考文献

Undeutsch HJ, Posabella A, Kotton DN, Hollenberg AN. Protocol for directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into thyroid follicular epithelial cells. STAR Protoc. 2025 Jul 24;6(3):103979. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103979.

来源：培养盒守护者