摘要：重组蛋白（recombinant protein）是通过基因工程手段，将目标基因导入合适的表达载体，在特定宿主细胞内表达并经过纯化得到的蛋白质。重组蛋白的出现极大推动了生命科学研究与生物制药的发展，被广泛应用于基础研究、疾病机制探索、结构生物学、药物筛选、诊断
重组蛋白（recombinant protein）是通过基因工程手段，将目标基因导入合适的表达载体，在特定宿主细胞内表达并经过纯化得到的蛋白质。重组蛋白的出现极大推动了生命科学研究与生物制药的发展，被广泛应用于基础研究、疾病机制探索、结构生物学、药物筛选、诊断试剂开发以及抗体或疫苗生产等领域。一个合适的重组蛋白不仅能够保证实验结果的可重复性，还能显著提高实验效率。
明确研究目的与实验需求
在选择重组蛋白之前，研究者必须首先明确自身实验的目的。例如，如果目的是用于体外功能研究，那么所需的蛋白必须具有正确的折叠和酶活性；如果是用于结构解析，则要求蛋白具有较高的纯度和单一的构象状态；如果是开发抗体或疫苗，则需要蛋白具备天然构象和必要的翻译后修饰；如果是用于动物实验甚至临床前研究，则必须满足生物安全和法规要求。
此外，还要考虑蛋白的特性需求，例如纯度标准是否要达到 90% 或以上，是否需要生物活性，是否依赖于糖基化或磷酸化等翻译后修饰，是否要求特定的多聚体状态或热稳定性。这些因素决定了后续选择表达系统和纯化方法的方向。最后，还需要结合实验规模与预算。如果仅用于探索性实验，成本控制可能更重要；而如果是大规模制备或临床应用，则稳定性与合规性是首要考量。
选择合适的表达系统
重组蛋白表达系统的选择是重组蛋白生产中最关键的一步。文献中通常将其分为几类：原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、植物表达系统以及无细胞表达系统。
原核表达系统如大肠杆菌，是最常见的选择，优点是成本低、培养简单、产量高、表达周期短，适合大规模生产。然而缺点是无法完成复杂的真核翻译后修饰，容易形成包涵体，折叠不正确，因此适合对修饰和构象要求不高的蛋白。
酵母系统如毕赤酵母或酿酒酵母，可以进行部分翻译后修饰，并能够分泌蛋白，从而简化纯化过程，成本也低于高等真核细胞。但其糖基化模式与哺乳动物不同，可能影响蛋白的功能或免疫原性。
昆虫细胞和杆状病毒系统能够完成较复杂的修饰，在某些膜蛋白或结构蛋白的表达中有明显优势，但其修饰仍然与哺乳动物存在差异，且成本高于细菌和酵母。
哺乳动物细胞如 HEK293 或 CHO 细胞，是最接近人体环境的系统，能够正确折叠并进行完整的修饰，是治疗性蛋白、抗体和高要求科研的首选。但缺点是成本高、操作复杂、培养周期长。
此外，植物系统和无细胞系统也逐渐受到关注。植物系统能进行大规模生产，但其糖基化模式不同于人类。无细胞系统则提供了灵活性和快速响应能力，适合小规模定制化需求，但成本相对较高。
载体构建与标签设计
在确定宿主系统后，需要合理设计表达载体。首先要选择合适的启动子。强启动子适合高水平表达，而诱导型启动子能够在特定条件下控制蛋白的表达时间，避免宿主过早产生应激反应。
其次是信号肽和分泌途径。如果需要蛋白在宿主外分泌表达，则必须在基因中加入适当的信号肽，以便蛋白进入内质网或分泌途径。
融合标签的设计也十分关键。常见的标签如 His 标签便于亲和层析纯化，GST 或 MBP 标签则能提高溶解性。很多标签可通过酶切位点去除，以避免对下游实验造成干扰。研究者需要根据蛋白特性决定标签的种类、位置和是否切除。
此外，基因优化也是常见手段。通过密码子优化，使基因序列更符合宿主的偏好，提高表达效率。同时也可根据需要去除跨膜区、信号肽等不利于表达的区域。
蛋白表达条件优化
在细菌中，表达温度是一个重要因素。通常降低温度能减少包涵体形成，促进正确折叠。诱导时间和诱导剂浓度也需要逐步摸索。培养基成分、添加辅因子或金属离子有时也会显著提高蛋白的活性。
选择不同的宿主菌株也会影响表达效果。有些工程菌株对折叠和二硫键形成更有优势，还有的菌株减少了宿主背景蛋白或内毒素水平。
在真核系统中，可以通过共表达伴侣蛋白（如分子伴侣或二硫键异构酶）帮助目标蛋白正确折叠。若为分泌蛋白，则需要优化信号肽和分泌通路的效率。
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重组蛋白纯化策略与质量验证
纯化是保证蛋白质量的关键环节。最常见的纯化方法是亲和层析，例如利用 His 标签的金属亲和层析。随后可以使用离子交换层析根据蛋白的电荷差异进一步分离。对于多聚体或聚集体问题，则需使用凝胶过滤，也称尺寸排阻层析，以获得单一构象的蛋白。
若使用了可切除标签，需在纯化后用特定切酶去除，并通过再次纯化去除标签和酶。
对于科研实验，通常要求蛋白纯度达到 90% 以上，而结构研究或临床用途则往往要求 98% 甚至 99% 以上。验证方法包括 SDS-PAGE 和 Western blot 来确认分子量和标签，质谱分析用于检测分子量和翻译后修饰，功能性检测则用于确认蛋白活性。若应用于动物实验，还必须检测内毒素水平，确保符合安全标准。
重组蛋白使用过程中常见问题
标签或修饰对功能的影响标签、额外序列可能影响蛋白构象或活性，尤其在结合蛋白、配体、抗体等应用中。必要时要与去标签版本对照。
表达宿主背景的问题如宿主中可能共表达相似蛋白、使得抗体或结合实验背景高；或者宿主翻译后的糖基化与天然蛋白不同，可能影响结合性或免疫反应。
批间差异与重复性来自不同批次或不同供应商的重组蛋白可能纯度、活性、修饰状态不同；使用前最好有 CoA（Certificate of Analysis），并做批次间比较。
内毒素与其他污染物特别是用于细胞或动物实验时，内毒素污染会严重影响实验结果。要测定内毒素水平，并在必要时进行去内毒素处理。
蛋白稳定性在实际条件下的验证在运行的 assay 条件（温度、pH、存在其他试剂如盐、缓冲剂、表面活性剂等）中，蛋白是否稳定、是否容易失活／聚集。
蛋白折叠及聚集体影响结构或活性实验在 X-射线晶体学或冷冻电镜中，聚集体会破坏晶体或造成图像噪声；在功能性 assay 中，聚集体可能导致非特异性结合或测定误差。
重组蛋白的选择与使用是一个系统工程。从目标明确、系统选择、载体构建、表达优化、纯化验证，到储存与应用，每一步都可能影响最终结果。随着技术的发展，越来越多的高通量、模块化方法正在缩短这一流程，但核心原则仍然是：根据蛋白的功能与实验需求，做出合理的选择，并严格进行质量控制。只有这样，才能确保实验结果的可靠性，并推动科研与应用不断向前发展。
来源：积极的辰小创
