L-乳酸生产新突破！江南大学团队改造酿酒酵母，实现无需中和剂高效生产

摘要：乳酸作为一种重要的生物基化学品，广泛应用于食品、医药、化妆品和可降解塑料（如聚乳酸 PLA）等领域。然而，微生物发酵生产 L-乳酸面临着一个棘手的问题。在发酵过程中，微生物对酸性环境的耐受性较差，随着 L-乳酸不断积累，发酵液的 pH 值会迅速下降，严重抑制微

乳酸作为一种重要的生物基化学品，广泛应用于食品、医药、化妆品和可降解塑料（如聚乳酸 PLA）等领域。然而，微生物发酵生产 L-乳酸面临着一个棘手的问题。在发酵过程中，微生物对酸性环境的耐受性较差，随着 L-乳酸不断积累，发酵液的 pH 值会迅速下降，严重抑制微生物的生长和代谢，导致发酵无法顺利进行。因此，传统微生物发酵生产 L-乳酸需要大量添加中和剂（如碳酸钙），不仅增加成本，还会产生大量副产品（如硫酸钙）。

为了实现无需中和剂的高效生产，近日，江南大学吕雪芹团队在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 发表了一篇题为“Adaptively Evolved and Multiplexed Engineered Saccharomyces cerevisiae for Neutralizer-Free Production of LLactic Acid”的研究。研究人员通过适应性进化和代谢工程改造，成功开发出一种能在极低 pH（pH 2.60）环境下高效生产L-乳酸的酿酒酵母菌株 TMG27，无需添加中和剂即可实现 76.2 g/L 的高产量。

首先，研究团队选择酿酒酵母作为改造对象，其不仅是公认安全的食品级微生物，同时酵母菌本身对酸性环境就有一定耐受性，从而为后续改造提供了良好基础。

图 | 酿酒酵母中 L-乳酸的生物合成途径

随后，研究人员利用适应性实验室进化技术，开始筛选耐 L-乳酸的酿酒酵母菌株。他们以 L-乳酸作为选择压力，对酵母菌株进行定向驯化。

为了避免酵母在进化过程中利用 L-乳酸作为碳源，研究人员敲除了编码 L-乳酸脱氢酶的 CYB2 基因，得到了 TMG1 菌株。接着，以 TMG1 为起始菌株，在含有 L-乳酸的培养基中，逐步降低 pH 值，从 6.80 一直降到 2.60，对菌株 TMG1 进行适应性实验室进化。经过 222 代的连续传代培养，终于筛选出了能在 pH 2.60 的 L-乳酸环境中生长良好的 TMG2 菌株。全基因组测序显示，这个渐进式的驯化过程使得菌株在膜脂组成、质子泵活性、应激响应系统等多个方面发生了适应性进化。

图 | 适应性进化策略后多代工程菌株的耐酸和生长情况

有了耐酸的底盘菌株，接下来就要提高L-乳酸的合成效率。在该过程中，研究人员采用了一种“推-拉-抑”策略。简单来说，"推"是指增强前体物质的供应；"拉"是强化目标产物的合成途径；而"抑"则是弱化或阻断竞争途径。

研究团队首先从"拉"的维度入手，比较了来自不同生物的 5 种乳酸脱氢酶（LLDH），最终选择了活性最高的乳酸乳球菌来源的酶基因进行表达。随后，他们发现乙醇合成途径与乳酸生产存在激烈的"资源竞争"，于是通过基因编辑技术，逐步删除了丙酮酸脱羧酶基因（PDC1、PDC6）和部分酒精脱氢酶基因（ADH1、ADH5），成功将代谢流导向乳酸合成。

在"推"的策略上，研究人员则对糖酵解途径进行了系统强化。他们通过过表达葡萄糖转运蛋白（HXT7）和三个关键限速酶（己糖激酶 HXK1、磷酸果糖激酶 PFK1 和丙酮酸激酶 PYK1），从而大大加速了代谢通路，从葡萄糖向丙酮酸的转化效率得到显著提升。最终，这一系列改造使得糖酵解通量较原始菌株提升了约 40%，为 L-乳酸合成提供了更充足的前体物质供应。

然而，随着改造的深入，研究人员发现了一个新的瓶颈问题：乳酸在胞内的过度积累会反馈抑制关键酶的活性，同时造成严重的质子应激。为解决这一问题，团队创新性地引入了疟原虫来源的乳酸转运蛋白 PfFNT。这种跨膜蛋白能够主动将胞内乳酸外排，维持细胞内 pH 稳定。通过优化表达水平，工程菌株的乳酸外排速率提高了 3.2 倍，有效缓解了产物抑制效应。

此外，为了增加 L-乳酸合成过程中关键辅因子 NADH 的供应，研究人员还进一步敲除了工程菌株中线粒体消耗 NADH 的相关基因 NDE1、NDE2，并过表达 GDH1 和 GDH2 基因，构建了一个能将 NADPH 转化为 NADH 的系统，使细胞质中 NADH 的供应更加充足，L-乳酸产量再次提高。