摘要：重组蛋白表达是生物学、药物开发、结构生物学、诊断研发等领域的基础技术。选择正确的表达系统（host / host‐expression system）对于蛋白的产量、活性、结构完整性以及下游应用决定性意义。一个看似简单的蛋白如果表达系统选错，可能大量表达不出、
重组蛋白表达是生物学、药物开发、结构生物学、诊断研发等领域的基础技术。选择正确的表达系统（host / host‐expression system）对于蛋白的产量、活性、结构完整性以及下游应用决定性意义。一个看似简单的蛋白如果表达系统选错，可能大量表达不出、折叠错误、承担错误的翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）或形成包涵体，导致失败。
重组蛋白表达系统选择流程框架
某文献中提出一个 “四个关键问题（decision points）”的流程，用来引导研究者选择合适表达系统。
1. 蛋白来源是原核(prokaryotic)还是真核(eukaryotic)?
如果目标蛋白本质上为原核蛋白，则通常使用原核表达系统，如大肠杆菌 (E. coli)；如果是真核蛋白，则可能需要真核系统来支持复杂的折叠及 PTMs。
2. 若是真核蛋白，是否需要翻译后修饰（PTMs）、多少个二硫键(disulfide bonds)、蛋白分子量 (MW)、是否是膜蛋白 / 蛋白复合体？
例如，如果蛋白含有多个 (≥4) 二硫键，或需要复杂的糖基化 (glycosylation)，或 MW 很大 (>100 kDa)，或是大型膜蛋白，则倾向使用真核系统（酵母、昆虫或哺乳动物细胞）。
3. 选择哪种真核系统：酵母 (yeast)、昆虫细胞 (insect cells)、哺乳动物细胞 (mammalian cells)？
真核系统之间主要差别体现在 glycosylation 类型（N‐、O‐糖基化的差异性）、蛋白折叠能力、分泌与分泌路径 (secretion pathways)、成本与速度。
4. 是否需要高产量 / 规模化表达 /频繁表达？
如果对蛋白产量要求高或者需要反复表达，那么“稳定细胞株” (stable cell line) 或者“使用病毒载体系统”（如 baculovirus in insect cells）通常值得投入较多时间与资源；若只是短期或小规模实验，可能选择快速的 transient expression（如哺乳动物细胞的转染表达）或发酵型酵母/细胞系。
通过回答上述四个问题，可以在 E. coli、酵母、昆虫、哺乳动物或某些“异类”(exotic)系统中做出合理选择。
各表达系统的优缺点比较
表达系统优势劣势适用情况大肠杆菌 (E. coli)快速、成本低、操作简单、菌体生长快；产量高；很多工具/质粒/株系成熟；适合原核蛋白，不需要复杂 PTMs 的情况。无或很有限的翻译后修饰（尤其是复杂糖基化）；难以正确折叠含多个二硫键、多域蛋白或膜蛋白；易形成包涵体；一些蛋白可能对 E. coli 毒性较大。原核来源蛋白；真核蛋白但结构简单、不需要糖基化；蛋白规模较小（一般小于 \~100 kDa）；研究初期快速表达、筛选或者做酶、抗原等用途。酵母 (Yeast, 如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia / Komagataella)真核系统，具有一定的 PTMs 能力（蛋白折叠、分泌、糖基化虽然与哺乳动物不同）；能做较高密度发酵；成本中等；相对容易培养与规模化。糖基化型态与哺乳动物不同（高 mannose / hyper‐mannose等）；分泌效率有时低；对某些蛋白折叠或分子间相互作用复杂性支持不足；可能出现蛋白降解问题。真核蛋白但对哺乳动物型糖基化要求不高；中等分子量／中等复杂性蛋白；需要中等产量；预算、设施不如哺乳动物细胞丰富。昆虫细胞 / Baculovirus 表达系统 (Insect / BEVS)真核系统；能做多种 PTMs（尽管与哺乳动物存在差异, 如sialylation程度不同）；蛋白折叠 /分泌能力比酵母好；可以表达较大的蛋白或蛋白复合体；比哺乳动物细胞成本低一些；规模扩大较为可行。昆虫糖基化非完全哺乳动物型；病毒操作需要设施安全控制；转染载体准备（baculovirus株）周期相对较长；某些蛋白稳定性或活性可能受限。需要较为复杂真核修饰但不要求完全哺乳动物型的蛋白；膜蛋白或复合体；中高量；结构生物学要求较高但预算比哺乳动物低。哺乳动物细胞 (Mammalian cells)提供最接近天然的折叠环境和 PTMs（如复杂 N‐糖基化、O‐糖基化、磷酸化、以及蛋白修饰/剪切/定位等）；适合复杂蛋白、抗体、疫苗蛋白、膜蛋白等；表达蛋白功能性高。成本高（培养基、设备、无菌空间、转染或病毒载体生产等）；培养周期慢；设施与技术要求高；产量通常比 E. coli 或酵母低；如果做 stable cell line 建立耗时。对蛋白功能性要求非常高、需要人类型 PTMs 的蛋白；抗体或者药物候选蛋白；临床/诊断应用；膜蛋白、高度复杂的蛋白复合体。其他需要考虑的关键因素
1. 目标用途（downstream application）
结构生物学（晶体学、电镜、NMR）：通常要求蛋白折叠良好、均一、尽可能接近天然修饰。
功能 /活性研究：需要确保 PTMs、辅因子、膜环境（若为膜蛋白）等正确。
抗体 /疫苗 /治疗蛋白：人性化修饰、免疫原性、糖型等至关重要。
工业酶 /大规模生物制剂：产量与成本要求往往比 PTMs 要求更宽松。
2. 蛋白稳定性 /可溶性 /折叠难度
多域蛋白、较大蛋白更易在表达中折叠不良。
二硫键数量：多个二硫键在还原环境中折断，需要分泌或在特定空间（如大肠杆菌的 periplasm）表达。
膜蛋白或含膜锚蛋白片段：表达在亲脂环境中或需要共表达伴侣／辅助蛋白。
3. 翻译后修饰（PTMs）
Glycosylation（N‐和 O‐型）；
磷酸化、羟基化、甲基化、脂肪酸化等；
蛋白末端剪切 / signal peptide；
有辅因子的蛋白，如需金属离子、辅酶、辅蛋白。
4. 表达产量与成本
含培养基、设备、人工、纯化过程等成本。
表达周期（从构建载体到得到纯化蛋白所需时间）。
规模试验 vs 规模生产的可行性。
5. 时间与资源限制
实验室或企业是否具备相应系统的设施与经验。比如有些实验室对哺乳动物细胞操作熟练，有些则没有；是否可获得 baculovirus vector 系统等。
操作复杂性与安全性要求（病毒载体、动物细胞可能需要更严格的实验室条件）。
6. 免疫原性 /临床应用要求
若蛋白用于人体用途，需要人类类型的糖基化、低免疫原性。表达系统可能影响外源糖基、非人类糖残基等。
合规性（GMP 条件、纯度的要求等）。
7. 可扩展性
若将来需要大规模生产，表达系统必须具备从研究规模放大到生产规模的能力。
重组蛋白表达系统选择流程建议
1. 收集蛋白的基本信息
* 来源（物种、原核 or 真核）
* 氨基酸序列：是否存在 signal peptide, transmembrane domains, glycosylation sites, cysteine 二硫键数目等
* 分子量 /结构（单域／多域／复合体）
* 有无已知辅因子、必需的 PTMs
2. 确定目标与用途
* 是用于结构研究、功能验证、免疫反应、疫苗、诊断、药物开发或工业应用？
* 是否对蛋白活性 /折叠 /糖基化有严格要求？
* 所需蛋白纯度、数量、时间节点。
3. 初步选择表达系统类别
根据第一步中蛋白属性，如果蛋白简单 – 原核系统可尝试；若真核蛋白且需要多重 PTMs、复杂结构，则考虑真核系统。
4. 比较真核系统内的选项
若确定真核系统，需要在酵母、昆虫、哺乳动物间比较：哪个可以提供所需 glycosylation 类型、分泌效率、成本、设施支持等。
5. 评估时间／资源与实验室能力
* 是否有经验做哺乳动物细胞转染或稳定株？
* 是否有 baculovirus 操作经验？
* 是否有设备、培养基、无菌操作支持这些系统？
6. 进行小规模试验（pilot）
在候选系统中做几个小规模表达测试，以验证可溶性、产量、活性或正确修饰。
7. 优化表达构建 /条件
* 载体选择，如强启动子、融合标签（tag）以帮助折叠或纯化、定位信号等。
* 密度、温度、诱导条件、共表达伴侣 /辅因子等。
* 如果是在真核系统中，检测 glycan 类型、翻译后修饰状态。
8. 决定最终系统并扩大规模
如果目标是生产大量蛋白或长期用途，投入建立 stable cell line 或 scale‐up insect / mammalian batch /发酵系统。
基于上述分析，下面是几个总结性建议，可用作快速参考：
先不要急于选最“高级”的系统，先评估蛋白属性与需求；往往一个简单系统已经足够。
规划好 downstream 活性／修饰要求，如果功能性依赖 PTMs 或结构完整性，真核系统一般不可或缺。
做好 pilot 试验，不同系统中小型表达以比较可溶性、产量及活性。
考虑成本与时间投入，尤其是设备、培养材料、纯化过程、操作复杂性等。
查看已有文献中的类似蛋白表达案例，经验可借鉴。
准备回退方案，例如如果在 E. coli 出包涵体，就尝试降温、融合标签、分泌到 periplasm，或切换到 insect / mammalian 系统。
来源：积极的辰小创
