摘要：游离脂肪酸（Free Fatty Acids, FFA）作为生物燃料、高值化学品及药物合成的重要原料，其微生物高效合成是合成生物学领域的核心挑战之一。传统代谢工程策略多聚焦于直接调控脂肪酸合成通路，但 FFA 的胞内积累易引发质子失衡、膜损伤及氧化应激等问题，
游离脂肪酸（Free Fatty Acids, FFA）作为生物燃料、高值化学品及药物合成的重要原料，其微生物高效合成是合成生物学领域的核心挑战之一。传统代谢工程策略多聚焦于直接调控脂肪酸合成通路，但 FFA 的胞内积累易引发质子失衡、膜损伤及氧化应激等问题，严重限制产量提升。
近日，天津大学曹英秀团队近期在 Nature Communications 发表题为“Genome-scale CRISPRi screen identifies pcnB repression conferring improved physiology for overproduction of free fatty acids in Escherichia coli”的论文，通过全基因组 CRISPRi 筛选技术，系统解析大肠杆菌生理调控网络，发现并优化关键基因，最终构建出 FFA 产量达 35.1 g/L 的工程菌株，刷新微生物合成 FFA 的纪录。这一成果不仅为脂肪酸生物制造提供了全新范式，更揭示了生理工程在细胞工厂构建中的全局性价值。
研究团队通过结合荧光激活细胞分选 (FACS) 和下一代测序 (NGS) 的基因组规模 CRISPRi 筛选。在首轮筛选中，编码多聚腺苷酸化酶 I（PAPI）的 pcnB 基因被鉴定为关键调控靶点：抑制其表达可使 FFA 产量从 747 mg/L 提升至 2992 mg/L。进一步机制研究表明，pcnB的抑制显著增强了质子消耗系统（GAD 系统）基因（如 gadA、gadX、gadE）的转录稳定性。通过减少 RNA 多聚腺苷酸化酶介导的降解，细胞在 FFA 合成过程中能更高效地中和胞内质子，从而缓解膜损伤、降低活性氧（ROS）水平并提升 ATP 供给，为高产表型奠定了生理基础。
图 | CRISPRi 筛选确定了 pcnB 抑制导致大肠杆菌中 FFA 过度产生
为突破单基因调控的极限，团队在 pcnB 抑制菌株基础上进行了第二轮全基因组 CRISPRi 筛选，从中发现外排泵基因 acrD 的协同增效作用。单独抑制 acrD 会导致膜完整性下降，但将其与 pcnB 抑制联用时，acrD 的抑制反而释放了更多外膜通道蛋白 TolC 资源，促使 AcrB 依赖的 FFA 外排效率提升至 80%。扫描电镜（SEM）显示，双基因抑制菌株（pcnBi-acrDi）细胞形态完整，膜损伤显著缓解。这一组合策略使 FFA 产量进一步增加 33%，达到 4120 mg/L，凸显了生理调控网络的协同优化潜力。
图 | 单独抑制 acrD 产量反而低，但它和 pcnB 抑制配合后，能够提升 FFA 产量
基于上述发现，团队最终引入脂肪酸合成转录调控因子 FadR 的组成型过表达，构建出三基因工程菌株 pcnBi-acrDi-fadR+。在 5 L 发酵罐中，该菌株表现出卓越的生产性能：41.7 小时内 FFA 产量达 35.1 g/L，生产强度为 0.84 g/L/h，碳转化率为 0.20 g/g 甘油。这一数据较已报道的产油酵母（如 Yarrowia lipolytica 9.67 g/L）、模式丝状真菌（如 Rhodococcus opacus 50.2 g/L）展现出更高效的能量代谢适配性，且生产效率达到放线菌的 1.76 倍。离心后发酵液顶部可见明显 FFA 油层，印证了其工业化分离的可行性。
从科学视角看，该研究突破了传统代谢工程对“单一通路优化”的路径依赖，首次通过全基因组筛选揭示非经典生理调控基因（pcnB、acrD）对生物合成的全局影响。pcnB 作为 RNA 代谢全局调控因子，其抑制引发的转录组重塑为理解微生物应激响应提供了新视角；而 acrD 与 pcnB 的协同效应，则证明了跨膜转运与细胞生理状态的动态耦合机制。
产业应用方面，该工程菌株的 FFA 生产效率已达到传统酯交换法生产生物柴油的原料需求阈值。结合大肠杆菌快速生长、易规模化培养的特性，未来可通过发酵工艺优化进一步降低成本。研究团队指出，下一步将探索该策略在长链脂肪酸、羟基脂肪酸等特种化学品合成中的普适性，并开发配套的提取纯化工艺。
参考链接：
1.Fang, L., Hao, X., Fan, J. et al. Genome-scale CRISPRi screen identifies pcnB repression conferring improved physiology for overproduction of free fatty acids in Escherichia coli. Nat Commun 16, 3060 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-58368-3
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来源：生辉SciPhi
