杀菌剂作用机制研究及新型杀菌剂分子设计方面取得重要进展

摘要：粮食安全是国家安全的重要基础。近年来农作物真菌病害的重发频发对粮食生产构成严重威胁。据估计，全球每年因植物病虫害造成的农作物损失超过2200亿美元。杀菌剂是防控农业病原真菌最经济有效的手段。甲氧基丙烯酸酯类（strobilurin）杀菌剂是继苯并咪唑类、三唑类

粮食安全是国家安全的重要基础。近年来农作物真菌病害的重发频发对粮食生产构成严重威胁。据估计，全球每年因植物病虫害造成的农作物损失超过2200亿美元。杀菌剂是防控农业病原真菌最经济有效的手段。甲氧基丙烯酸酯类（strobilurin）杀菌剂是继苯并咪唑类、三唑类之后第三类具有重要里程碑意义的农用杀菌剂。该类杀菌剂作用于线粒体呼吸链bc1o位点，在细胞色素bL1之间的电子传递，影响三磷酸腺苷（ATP）产生，干扰病原菌体内的能量循环。该类杀菌剂具有广谱、渗透、快速分布等特点和较好的环境相容性，且耐雨水冲刷，持效期长，被广泛应用于真菌和卵菌的防治。吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin，PYR）和嘧菌酯（Azoxystrobin，AZO）是该类代表性的杰出代表，其年销售额均超过15亿美元。然而，由于作用位点单一，植物病原菌对strobilurin类杀菌剂的抗药性日益严重，杀菌剂抗性行动委员会将该类杀菌剂归为高抗性风险杀菌剂。Metyltetraprole（MET）是由巴斯夫和住友化学共同开发的四唑啉酮类杀菌剂，被FRAC归为单独的一类新型Qo位点抑制剂。MET可用于防治对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂已产生抗性的病原菌，对多种真菌病害有较好的防效，包括重要的麦类病害（如小麦叶枯病）。然而，MET的作用模式和反抗性机制尚不明确。近日，绿色农药全国重点实验室（华中师范大学）杨光富教授团队在国际著名期刊《Journal of the American Chemical Society》上发表了题为“Cryo-EM Structures Reveal the Unique Binding Modes of Metyltetraprole in Yeast and Porcine Cytochromebc1 Complex Enabling Rational Design of Inhibitor”的研究论文。该研究采用冷冻电镜技术阐明了MET在真菌及哺乳动物复合物III中不同的结合模式。将MET与strobilurin类杀菌剂PYR的结合模式进行比对，首次从原子水平上阐明了MET的反抗性机制，揭示了四唑啉酮类新型药效团的重要性。在此基础上，通过计算化学方法对MET进行了结构优化，设计出了活性和选择性均更高的新型抑制剂YF23694。

MET和PYR均属于芳基吡唑类化合物，两者化学结构很相似，最大的不同来自药效团部分。MET和PYR对真菌酵母复合物III均有较好的抑制活性，抑制常数Ki分别为0.92 nM和0.76 nM。进一步通过冷冻电镜解析了分别结合了MET（2.52 Å）和PYR（2.42 Å）的酵母复合物III结构，结果显示两个抑制剂均结合在Qo位点，结合模式相似（图1）。通过分子模拟对G143A突变后MET和PYR的结合模式进行研究，结果显示G143A突变后导致PYR的官能团翻转了180°，失去了与复合物III重要的相互作用，结合能大大降低。而MET由于官能团较小，突变前后结合模式几乎相同。这一结果为MET对G143A突变后的抗性菌株仍具有较好防效提供了合理的解释，也突出了四唑啉酮官能团的重要性。

图1. MET与PYR在酵母复合物III中的结合模式及抗性机制研究

此外，在抑制活性测定和光谱实验中发现MET对酵母和猪心复合物III的影响差异较大，推测MET可能在两个物种中的结合模式不同。为了验证该猜想，该团队进一步解析了MET与猪心复合物III的结构（2.53 Å），并与PYR（2.37 Å）进行了比对（图2）。令人惊奇的是，MET在猪心复合物III中同时结合于Qo和Q位点，在酵母中仅结合于Q位点。而PYR在猪心和酵母中都只结合在Qo位点。这也导致了MET对猪心和酵母的抑制活性差异较大，反映了MET具有更好的种属选择性。最后，团队在这些结构研究的基础上，借助计算化学对MET进行结构拆分和碎片筛选，设计合成了一系列四唑啉酮衍生物。其中YF23694显示出优异的酶抑制活性和种属选择性，并且杀菌活性结果显示在25 mg/L的剂量下，其对黄瓜白粉病的防治效果优于MET。这些研究结果为高活性和高选择性的复合物III杀菌剂的设计提供了新的思路。