摘要：“Nucleolin–RNA interaction modulates rotavirus replication”于2024年2月发表在《Journal of Virology》期刊，该研究显示轮状病毒的复制受到核仁素的负调控，其调控方式是通过核仁素与病毒

“Nucleolin–RNA interaction modulates rotavirus replication”于2024年2月发表在《Journal of Virology》期刊，该研究显示轮状病毒的复制受到核仁素的负调控，其调控方式是通过核仁素与病毒 RNA 上 G4 结构的序列直接相互作用来实现的。

病毒依赖细胞蛋白来完成其复制周期。就轮状病毒而言，在其复制周期中细胞 RNA 结合蛋白所起的作用，是一个尚未得到充分研究的领域。在这项研究中，作者首次证实了核仁素与恒河猴轮状病毒（RRV）的病毒 RNA 之间存在相互作用。核仁素是一种细胞蛋白，它在核糖体 rRNA 的代谢和核糖体生物发生过程中发挥作用，而它似乎对恒河猴轮状病毒（RRV）的病毒颗粒数量和病毒 RNA 拷贝数具有调控作用。作者的研究为当前的轮状病毒复制模型增添了一个新的要素，即细胞蛋白可以对轮状病毒的复制起到负调控作用。轮状病毒引发的肠胃炎给全球健康带来了沉重负担，尤其是对 5 岁以下的儿童影响很大。轮状病毒是呼肠孤病毒科（Sedoreoviridae）的成员，属于无包膜病毒，其特征是拥有一个三层的蛋白质衣壳。它们的基因组由 11 个双链 RNA（dsRNA）片段组成，这些片段编码六种病毒结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6 和 VP7）以及六种非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5 和 NSP6）。在感染过程中，轮状病毒采用复杂的策略，通过调节细胞环境并劫持宿主蛋白来翻译病毒蛋白和复制其基因组。

核仁素（Ncl）是一种真核生物的磷蛋白，主要存在于细胞核中，其中心区域具有一个 RNA 结合结构域，该结构域包含四个 RNA 识别基序，能够与 RNA 分子相互作用。这种蛋白在核糖体组装、rDNA 转录以及前体 rRNA 的修饰和加工过程中发挥着多种作用。据报道，核仁素参与了几种 RNA 病毒与细胞的结合和进入过程，从而影响了这些病毒的初始感染过程此外，它还与杯状病毒的病毒复制和翻译以及登革热病毒颗粒的组装有关。

为了进一步明确具有 RNA 结合能力的细胞蛋白在轮状病毒复制过程中所起的作用，作者评估了核仁素（一种已知能与多种 RNA 病毒相互作用的 RNA 结合蛋白）在轮状病毒复制周期中的作用。为此，作者评估了通过 RNA 干扰（RNAi）技术沉默核仁素表达，对单个复制周期内有感染性的轮状病毒子代产量的影响。在这些实验中，将接种在 48 孔板中的 MA104 细胞用一组特异性靶向核仁素的 siRNA 进行转染，转染 72 小时后，用四种不同的轮状病毒毒株感染这些细胞，分别是恒河猴轮状病毒（RRV）、猿猴轮状病毒 SA11（SA11）、牛轮状病毒（UK）和 人轮状病毒毒株（Wa），感染复数（MOI）为 3。在感染后 15 小时（hpi），收获被感染的细胞，并通过噬斑形成试验测定在这些条件下产生的病毒的病毒滴度（图1A）。

作者发现，与转染了非靶向对照（NT）siRNA 的细胞相比，从核仁素被沉默的细胞中获得的四种轮状病毒毒株的病毒滴度均有所增加。每种毒株的增加倍数分别为：恒河猴轮状病毒（RRV）6.3 倍，猿猴轮状病毒 SA11（SA11）4.8 倍，牛轮状病毒（UK）3.3 倍，Wa 轮状病毒毒株（Wa）2.4 倍（图1A）。这一观察结果表明，核仁素对这四种不同毒株的轮状病毒感染均起到负调控作用。通过用抗核仁素抗体进行蛋白质免疫印迹，并使用抗波形蛋白抗体（波形蛋白）对上样对照进行标准化后，通过光密度测定法评估得出，核仁素的敲低效率为 91%（图1B）。在所研究的条件下，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放试验测定，用靶向核仁素的 siRNA 处理的细胞中未检测到明显的细胞活力变化（图1C）。

图1 核仁素表达的敲低促使RRV、SA11、UK 和 Wa 株轮状病毒的滴度增加。（A）在 48 孔板中培养的 MA104 细胞，用非靶向（NT）siRNA 或核仁素 siRNA 进行转染。在转染后 72 小时（hpt），细胞以感染复数（MOI）为 3 的 RRV、SA11、UK 和 Wa 型轮状病毒进行感染，并在感染后 15 小时收获细胞。所示数据为三个独立实验的算术平均值 ± 标准差。（B）用指定的 siRNA 转染的细胞在转染后 72 小时收获，通过免疫印迹分析检测蛋白质，使用针对核仁素（Ncl）的抗体，并以波形蛋白（Vim）抗体作为上样对照。使用 ImageJ 软件对蛋白质免疫印迹中 Ncl 和 Vim 条带进行光密度分析。（C）按照制造商的说明，使用乳酸脱氢酶（LDH）释放测定法评估细胞活力。显示的是三个独立实验的算术平均值 ± 标准差。

为了确定病毒复制周期中受核仁素敲低影响的阶段，作者评估了病毒复制的初始阶段。为此，用核仁素或非靶向（NT）小干扰RNA（siRNA）预先处理过的MA104细胞，以0.02的感染复数（MOI）感染恒河猴轮状病毒（RRV）。将细胞固定，然后使用轮状病毒颗粒的兔多克隆抗体（抗全病毒颗粒抗体，anti-TLPs），通过空斑形成试验对感染细胞的数量进行定量。在核仁素沉默的细胞和NT对照细胞中测得的病毒滴度在两组之间没有统计学上的显著差异（图2A），这表明核仁素的减少不会影响病毒进入细胞。 为了评估核仁素对形成中间衣壳和外衣壳的病毒结构蛋白合成的影响，作者通过对敲低核仁素的细胞裂解液中三种病毒结构蛋白（VP4、VP6和VP7）的丰度进行光密度测定分析，来分析病毒蛋白的含量。将MA104细胞转染核仁素siRNA，然后在转染后72小时以感染复数为3的轮状病毒RRV进行感染。在感染后15小时收获细胞，用抗TLP多克隆抗体通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）免疫印迹法分析感染细胞的裂解液。在对照NT siRNA处理的细胞和核仁素沉默的细胞之间没有观察到统计学上的显著差异（图2B和C）。这些结果证实，在核仁素表达降低的情况下，轮状病毒结构蛋白的表达量不受影响。

图2 核仁素低表达对轮状病毒感染性或病毒蛋白合成没有影响。（A）如前所述，在96孔板中培养的MA104细胞用非靶向（NT）或核仁素（Ncl）siRNA进行转染。随后，细胞以感染复数（MOI）为0.02的恒河猴轮状病毒（RRV）进行感染，并按照“材料与方法”部分所述，在感染后15小时通过病灶形成试验测定病毒滴度。将转染了非靶向siRNA的感染细胞数量视为100%的感染性。（B）MA104细胞用非靶向或核仁素siRNA进行转染，然后以感染复数（MOI）为3的RRV进行感染。在感染后15小时，收获细胞，并通过免疫印迹分析检测蛋白质。该分析使用了一种能识别轮状病毒结构蛋白（TLPs）的多克隆抗体、一种用于验证干扰效果的抗核仁素（Ncl）抗体，以及一种波形蛋白（Vim）抗体作为上样对照。（C）使用ImageJ软件对从（B）中所示的蛋白质免疫印迹获得的三种轮状病毒结构蛋白（VP4、VP6和VP7）和波形蛋白（Vim）进行光密度分析。给出的是三个独立实验的算术平均值±标准差。

在轮状病毒感染期间，负义RNA的合成是衡量基因组复制的一个指标，因为这是合成感染性子代病毒中的基因组双链RNA的一个必要步骤。为了量化先前用核仁素siRNA处理过的、被恒河猴轮状病毒（RRV）感染的细胞中基因组RNA的合成情况，通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）扩增轮状病毒S10基因负链的特定丰度作为一个指标。为此，以感染复数（MOI）为3的RRV对核仁素被敲低的MA104细胞进行感染，并从在感染后0小时、4小时、8小时和12小时收集的样本中提取总RNA。数据以倍数增加的形式表示，并且如先前报道所述，将用非靶向（NT）siRNA转染的细胞在感染后12小时产生的RNA量作为倍数变化的一个单位。 为了定量S10基因负链和正链的数量，作者使用了一条用于定量PCR分析的标准曲线，该标准曲线基于一个含有RRV S10基因片段互补DNA（cDNA）的质粒构建体（见材料与方法）。在核仁素表达被沉默的条件下，病毒负链的合成从感染后4小时开始增加，一直持续到感染后12小时，与用非靶向siRNA处理的对照细胞中观察到的RNA合成相比，显著增加了5.8倍（图3A）。 作者还测定了S10基因正链的丰度，它代表了双链RNA基因组合成以及从转录过程中合成的信使RNA（mRNA）的总和。与作者在S10基因负链中观察到的情况类似，与对照沉默细胞相比，在感染后8小时观察到S10 RNA正链丰度增加，在感染后12小时显著增强了3.5倍（图3B）。这些发现支持了这样一种观点，即在核仁素表达被沉默的条件下，病毒RNA合成增加，这促成了所观察到的子代病毒产生量的增加。

图3 在核仁素沉默的细胞中，病毒RNA负链和正链的合成得到增强（A）S10基因负链水平和（B）S10基因正链水平。给出的是三个独立实验的算术平均值±标准差。

为了证明核仁素与轮状病毒RNA之间存在潜在的相互作用，作者进行了免疫沉淀（IP）实验。在该实验中，使用了一种针对核仁素的单克隆抗体对受感染或模拟感染（未感染病毒）的细胞裂解物进行免疫沉淀。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增轮状病毒的1、4和10号RNA片段，来检测免疫沉淀复合物中轮状病毒RNA的存在情况。作为阳性对照，使用了针对病毒非结构蛋白NSP3的抗体进行免疫沉淀，因为已知这种蛋白能特异性地结合所有轮状病毒RNA片段。此外，作为阴性对照，使用了针对蛋白磷酸酶1（PP1）的抗体，此前已证明该抗体不与轮状病毒RNA相互作用。 通过使用针对核仁素、NSP3和PP1的特异性抗体对沉淀物进行蛋白质免疫印迹（western blot）分析，验证了免疫沉淀实验的有效性（图4A）。当使用核仁素单克隆抗体对细胞裂解物中可能存在的蛋白质-RNA复合物进行免疫沉淀时，从受感染细胞中获得了一条751碱基对的RT-PCR扩增产物，该产物对应于轮状病毒的S10片段（图4C）。当使用针对NSP3的多克隆抗体进行免疫沉淀时，也检测到了这条扩增产物。重要的是，使用PP1抗体时未观察到扩增条带。为了证实病毒感染期间轮状病毒的其他片段也能与核仁素结合，进行了额外的免疫沉淀实验。且使用了多对引物来扩增恒河猴轮状病毒（RRV）的三个不同片段，即1号片段（S1）、4号片段（S4）和10号片段（S10）。使用特异性抗体对沉淀物中核仁素、NSP3和PP1的存在情况进行了验证（图4B）。通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），作者证实了对应于S1、S4和S10的三个不同轮状病毒片段的存在（图4D）。综上所述，这些结果为核仁素与恒河猴轮状病毒（RRV）mRNA的三个不同片段之间存在特异性相互作用提供了证据。

图4 核仁素在轮状病毒感染的细胞中与病毒RNA结合（A）添加或不添加抗体进行免疫沉淀（IP）所检测到的蛋白质的可视化结果。（B）input中的蛋白质以及用于RNA检测的免疫沉淀样品中所检测到的蛋白质的可视化结果。（C）用TRIzol提取每个免疫沉淀样品中存在的RNA，并通过end-point RT-PCR扩增恒河猴轮状病毒（RRV）的第10片段。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中进行分离。以轮状病毒的RNA作为模板作为反应的阳性对照（+C），以水作为反应的阴性对照（-C）。（D）使用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）鉴定与S1、S4和S10对应的RNA，并描绘出相对于标准曲线的RNA拷贝数。所展示的数据为三个独立实验的算术平均值±标准差。

为了确定核仁素与轮状病毒S10 RNA的结合是否是因为与已鉴定的G-四链体（G4）结构域的相互作用所介导的，将MA104细胞转染了阳性对照物AGRO100，这是一种已知能形成G-四链体结构并特异性结合核仁素RNA结合结构域的寡核苷酸。作为阴性对照，将细胞转染了CRO26，这是一种与AGRO100序列相同的寡核苷酸，其中的鸟嘌呤被胞嘧啶所取代。如“材料与方法”部分详细所述，在转染前对这些序列进行了体外折叠处理。在这些实验中，先前已转染了上述任一寡核苷酸的MA104细胞以感染复数（MOI）为3的恒河猴轮状病毒（RRV）进行感染。在感染后15小时，收集被感染的细胞，并按照先前描述的方法测定子代病毒的产生情况。作者发现，与转染了CRO26的对照细胞相比，转染了AGRO100的细胞中病毒产量增加了1.5倍（图5A）。这一发现表明，核仁素的RNA结合基序参与了对轮状病毒感染性颗粒产生的调控。为了确定在轮状病毒基因组中预测的G-四链体结构是否能模拟AGRO100的作用，作者合成了在RNA S10中鉴定出的三个G4序列（G4-1、G4-2和G4-3）。对这些序列进行体外折叠处理后，将它们分别转染到MA104细胞中，以评估它们对病毒产量的影响。值得注意的是，与对照寡核苷酸（CRO26）相比，用寡核苷酸G4-1和G4-3处理的RRV感染细胞显示出病毒产量显著增加，分别增加了1.6倍和2.1倍。相比之下，与对照组相比，寡核苷酸G4-2对病毒产量没有显著影响（图5B）。作为额外的对照，在体外折叠处理前转染了寡核苷酸G4-3（未折叠的G4-3，UnG4-3）。该实验结果表明，与阴性对照CRO26相比，病毒滴度没有变化，这表明G4结构的折叠对于影响病毒的复制是必要的（图5C）。最后，为了排除所观察到的感染性病毒产量增加可能是由于RRV的G-四链体区域与其他细胞蛋白的非特异性相互作用所导致的这种可能性，并确定病毒产量增加与RRV的G4序列和核仁素的结合之间的直接关联，通过RNA干扰（RNAi）使MA104细胞中核仁素蛋白的表达沉默。在转染后24小时，随后将细胞用折叠后的G4-3寡核苷酸转染48小时。在这段时间之后，用RRV感染细胞，并在37摄氏度下培养，于感染后15小时 。对感染性子代病毒的定量分析显示，在核仁素沉默的细胞中测得的病毒滴度与另外转染了RRV G4-3的细胞相比，没有统计学上的显著差异（图5D）。 这些结果表明，G-四链体结构通过阻断核仁素的RNA结合结构域，有利于轮状病毒RNA的复制。此外，这些结果还表明，在RRV的S10中发现的特定G-四链体序列（G4-1和G4-3）可能是核仁素的结合位点，而这种相互作用可能是细胞的抗病毒反应之一。

图5 具有预测 G4 结构的寡核苷酸对轮状病毒子代产生的影响。（A）CRO26 和 AGRO100。（B）存在于 RRV S10 中的三个不同的假定 G4 区域的序列：G4-1（116–132 核苷酸（nt））、G4-2（572–607 核苷酸）和 G4-3（717–737 核苷酸）。（C）CRO26、未折叠的 G4-3 序列（UnG4-3）和折叠后的 G4-3。（D）在 48 孔板中培养的 MA104 细胞用核仁素 siRNA 使其基因沉默。在沉默 24 小时后，用轮状病毒 G4-3 寡核苷酸（Ncl+G4-3）转染细胞。在转染 48 小时后，细胞以感染复数（MOI）为 3 的 RRV 进行感染。在感染后 15 小时，裂解细胞，并通过病灶形成试验测定细胞裂解物中的病毒滴度。所展示的数据为三个独立实验的算术平均值 ± 标准差。

这项研究强调了核仁素在轮状病毒感染过程中的重要性，它通过负向调节病毒RNA的合成以及感染性病毒的产生来发挥作用。当在 MA104 细胞中敲低核仁素的表达时，病毒 RNA（vRNA）的拷贝数和病毒子代的数量都会增加。免疫沉淀实验表明，核仁素有可能通过与轮状病毒 RNA 上的 G -四链体 RNA 结构结合来与之相互作用。此外，作者使用了预测能够形成 G -四链体结构、并且模拟轮状病毒基因片段 10 中序列的合成序列，证实了这些区域会阻碍核仁素的结合，从而导致有感染性的病毒颗粒的产生增加。这篇研究对探索具有RNA结合结构域的蛋白质在RNA病毒感染中具有重要意义。

本期编辑：吃一口小猫

来源：小刘的科学讲堂