摘要：Pages 557-569 | Received 24 May 2021, Accepted 20 Jul 2021, Accepted author version posted online: 28 Jul 2021, Published online:

Kidney stone proteomics: an update and perspectives

Paleerath Peerapen &

Visith Thongboonkerd

Pages 557-569 | Received 24 May 2021, Accepted 20 Jul 2021, Accepted author version posted online: 28 Jul 2021, Published online: 06 Aug 2021

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蛋白质组学(Proteomics)一词，源于蛋白质(protein)与基因组学(genomics)两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。” 1995年(也有1994，1996年之说) Marc Wikins首次提出蛋白质组(Proteome)的概念1，1997年，Peter James (就职于有欧洲MIT之称的瑞士联邦工学院(ETH)又在此基础上率先提出蛋白质组学的概念2。基因组学和蛋白质组学的概念又进一步催生了N多的各种各样的组学(omics)，两者的诞生和发展，也使系统生物学成为可能。

蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。确实，那些世界范围内销路最好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来利益。蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。

肾结石病的主要问题，是在全球几乎所有地区的患病率较高和结石手术后的高复发率。尽管过去付出了巨大的努力，但其致病机制仍不清楚，需要进一步阐明。因此，蛋白质组学已成为在细胞、亚细胞、分子、组织和整个生物体水平上揭示此类复杂疾病机制的重要工具。

这篇综述提供了肾结石疾病的简要概述，随后更新了蛋白质组学，以研究尿结石形成的调节剂、基质蛋白、细胞对不同类型/剂量草酸钙 (CaOx) 晶体的反应、性激素和其他刺激物的反应、晶体-细胞相互作用、晶体受体、分泌和细胞外囊泡 (EV)的作用，所有这些都有助于更好地了解疾病机制。最后，讨论了这些获得的数据在临床上的未来挑战和转化。

尿液蛋白质组学知识用于探索重要的结石形成的调节剂（抑制剂或促进剂）将有助于早期发现无症状病例，从而及时预防症状、并发症和新结石形成。此外，这些调节剂可能成为未来通过药物或其他干预手段成功治疗和预防肾结石疾病的新治疗靶点。

关键词：

晶体-细胞相互作用晶体受体质谱肾结石蛋白质组尿液蛋白质组学尿石症

肾结石病（或者肾结石或尿石症）是主要由草酸钙 (CaOx) 晶体在肾脏或泌尿道内沉积的固体物质引起的。随着患病率和发病率的增加，它仍然是全球多个国家的医疗保健负担 [ 1-4 ]。这种疾病的另一个主要问题，是它在去除结石后的高复发率 [ 5 ]。因此，先前的几项研究试图解决这种疾病的病理生理机制，旨在改善治疗和预防。尿液和肾结石是研究肾结石成分及其相关病理和病因作用的重要标本 [ 6 , 7 ]]。一些分子，无论是小分子化合物还是大分子（即蛋白质、糖胺聚糖 (GAG)），已在尿液和结石基质中被发现，并被认为与结石形成过程有关 [ 6 , 7 ]。已经使用各种细胞系进行了几项体外细胞研究，以探索潜在的细胞机制 [ 8 , 9 ]。此外，还引入了体外晶体测定以进一步确定可能与肾结石形成相关的那些分子的晶体调节活性 [ 10-13]。然而，这些早期研究的规模和范围仅限于少数特定化合物或感兴趣的分子，以及一些先前的信息。

在过去的几十年里，蛋白质组学被引入研究各种疾病的发病机制[ 14-16 ]。蛋白质组学是一种强大的高通量技术，可以同时检查生物样品中大量的蛋白质。它已被广泛应用于研究肾脏组织、细胞和尿液中蛋白质在多种肾脏疾病中的功能相关性，例如糖尿病肾病 [ 17 ]、狼疮性肾炎 [ 18 ]、肾小球肾炎 [ 19 ] 和慢性肾病 (CKD) [ 20]。此外，尿液蛋白质组学已被应用于各种肾脏疾病的生物标志物发现，而肾活检的蛋白质组学已被用于包括淀粉样变性在内的许多肾脏疾病的分化和分类 [ 21 , 22 ]。毫无疑问，蛋白质组学技术对肾结石研究产生了很大影响，以研究与肾结石形成有关的蛋白质和相关途径。与其他领域一样，预计来自应用于肾结石研究的基于蛋白质组学的方法的数据可以转化为临床 [ 23 , 24 ]。

在 PubMed 的初始文献搜索中，使用关键字（“蛋白质组学”或“蛋白质组学”或“蛋白质组学”）和（“肾结石”或“肾结石”或“钙结石”或“肾结石”或“尿石症”或“钙草酸盐”或“肾结石”或“肾结石”），共检索到 290 篇文章（截至 2021 年 7 月）。剔除非原创文章，去除多余条目，剔除不相关的出版物，以及无法全文访问或以英语以外的其他语言发表的文章后，本次综述共纳入50篇原创文章（图1）。它提供了有关尿调节剂、结石基质蛋白、晶体-细胞相互作用、晶体受体、分泌组和细胞外囊泡 (EV) 的蛋白质组学研究的最新信息，所有这些都有助于更好地了解疾病机制（图 2）。最后，讨论了将这些获得的数据转化为临床。

图 1本综述检索文献的纳入排除标准流程图

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图 2.与本综述内容相关的肾结石形成机制示意图

二、肾结石病概述

肾结石病在男性中比女性更常见 [ 1-4 ]。然而，在过去十年中，性别差距变得越来越近 [ 2 , 25 ]。病程可以从偶然发现或无症状到严重的症状和并发症（例如肾绞痛、血尿、肾盂肾炎、尿路梗阻）。肾结石病也是众所周知的 CKD 危险因素，可能最终导致终末期肾病 (ESKD) [ 26 , 27 ]。这种疾病的诊断通常依赖于成像（例如计算机断层扫描）以及来自病史和血液/尿液特征的额外信息 [ 28 ]。

已经建立了几种结石清除方法，从药物管理（例如，使用药物促进结石自发通过的药物排石疗法）到手术去除（例如体外冲击波碎石术、输尿管镜取石术、经皮肾镜取石术）[ 29 , 30 ]。手术去除方法的类型取决于疾病的严重程度，并取决于结石类型、位置、大小和相关并发症（如果有的话）[ 29 , 30 ]。然而，结石复发率相当高，并且在随后的发作中增加，在第四次或更高发作后从大约 3% 增加到 >17% [ 31]。由于这些原因，这种疾病带来的经济负担与直接（例如诊断和管理）和间接（例如收入损失和收入能力下降）成本有关，并不微妙[ 32 , 33 ]。

CaOx是在大约 80 %的结石形成者（携带肾结石的患者）中发现的最主要的肾结石类型[ 7、34、35 ]。CaOx 结石的结晶成分包括一水 CaOx (COM) 和/或 二水CaOx (COD) 晶体 [ 7 , 34 , 35 ]。CaOx 肾结石可以主要在肾小管腔内或外部（在肾间质）开始。在肾小管内，由于肾小管液中离子过饱和，结晶成分会以结晶析出 [ 36 , 37]。微小的晶体可以粘附在肾上皮细胞的顶端表面，细胞损伤会促进这一过程[ 36-38 ]。此外，游离晶体可以进一步生长和自聚集 [ 36 , 39 , 40 ]。当它们的尺寸足够大时，它们不能通过管腔，然后卡在肾小管段内 [ 36 ]。然后沉积的晶体作为进一步扩大的病灶，结石开始形成。对于间质机制，磷酸钙 (CaP) 的过饱和在间质室内很常见，导致斑块的形成，即 Randall 斑[ 41 , 42]。与炎症反应一起，一些斑块侵蚀到泌尿空间或肾盂，在那里它们暴露于过饱和的钙离子和草酸盐离子 [ 41 , 42 ]。然后，Randall 斑块作为 CaOx 晶体沉积和形成结石的病灶 [ 42-44 ]。

根据蛋白质组学数据，正常尿蛋白的原始来源主要来自肾细胞（~70%）和血浆滤液（~30%）[ 45-47 ]。一些来自健康个体的尿蛋白被归类为肾结石形成抑制剂 [ 48 ]。在先前使用基于质谱 (MS) 的分析的研究中，基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI-TOF) MS 和电喷雾电离四极杆飞行时间串联 MS (ESI- Q-TOF MS/MS)，连同 CaOx 晶体生长测定，尿三叶因子 1 (TFF1)，一种阴离子尿蛋白，被确定为一种新型有效的肾结石抑制蛋白 [ 49]。这种抑制剂是使用 DEAE（二乙氨基乙基）吸附从健康个体的尿液中分离出来的，然后是 HiLoad 16/60 Superdex 75 凝胶过滤 [ 49 ]。尽管纯化的蛋白质组分中蛋白质浓度最低，但 TFF1 对 CaOx 晶体生长的抑制活性最高 [ 49 ]。随后的一项功能研究还发现，TFF1 除了作为晶体生长抑制剂外，还具有抑制 CaOx 晶体聚集的能力 [ 50 ]。因为 GAG（例如肝素）具有结石抑制活性，所以使用亲和纯化方法从正常尿液中纯化肝素结合蛋白 [ 51 ]。MS/MS 分析从纯化的级分中鉴定出超过 80 种肝素结合蛋白 [51 ]。已经提出这组肝素结合蛋白也可以调节 CaOx 肾结石的形成。在正常尿液中发现肾结石抑制剂可以解释为什么在正常肾脏中不会出现结石。

另一方面，被困在结石基质中的尿蛋白被认为主要作为结石促进剂。液相色谱 (LC) 与 MS/MS 耦合用于鉴定掺入 CaOx 晶格的尿蛋白 [ 52 ]。有趣的是，掺入 COM 晶体的蛋白质的身份与掺入 COD 晶体的蛋白质有些不同，只有少数常见蛋白质 [ 52 ]。此外，将结石形成者的尿液和结石基质的蛋白质组图谱与正常尿液蛋白质组图谱进行比较，发现 S100A8 和纤连蛋白仅存在于患者的尿液和结石基质中，而未在健康尿液中发现，这表明它们的关键作用肾结石形成 [ 52 ]。

在另一种使用无标记定量蛋白质组学的方法中，之前的一项研究表明，与正常尿液相比，结石形成者尿液中的铜蓝蛋白增加了 2 倍以上 [ 53 ]。体外结晶试验结果表明，铜蓝蛋白对 CaOx 结晶具有促进作用，呈剂量依赖性[ 53 ]。然而，高丰度调节蛋白（如白蛋白、bikunin 和尿调节蛋白）的丰度水平没有显着差异[ 54 ]。子集分析显示，两组样品之间阴离子和阳离子蛋白的相对数量不同。具有等电点的阳离子蛋白个数（pI) >6.5 在结石形成者的尿液中显着高于正常尿液 [ 54 ]。这一发现表明尿蛋白的离子位移可能与蛋白质聚集和晶体聚集的风险增加有关 [ 54 ]。

尿液蛋白质组的改变也被用于研究抗结石剂的保护机制。接受柠檬酸盐方案的个体尿结石危险因素降低，体外检查显示柠檬酸盐抑制 COM 晶体生长活性 [ 55 ]。应用基于 MS/MS 的无标记定量分析来研究接受钙补充剂 6 个月与接受安慰剂的结石形成者的尿蛋白成分 [ 56]。柠檬酸盐处理诱导了 17 种显着改变的蛋白质（16 种减少，只有一种增加）。减少的蛋白质主要参与免疫、炎症和纤维化，这表明钙补充剂在免疫反应、抗炎和抗纤维化过程中发挥作用 [ 56 ]。有趣的是，治疗后唯一一种水平升高的蛋白质是尿调节素，此前曾报道其为结石抑制剂 [ 57 ]。因此，柠檬酸盐可能会触发泌尿道中的防御机制，以防止 COM 结晶和生长。

此外，还使用蛋白质组学方法研究了常见泌尿微生物在肾结石形成中的致病作用。Tavichakorntrakool等人[ 58 ] 对从结石形成者的导尿管尿液样本以及结石基质的皮质和病灶中分离出的细菌进行表征，以研究尿路感染 (UTI) 与肾结石形成之间关联的机制。此后，使用 2D-PAGE 和 nanoLC-MS/MS [ 59 ] 从结石形成者的尿液和结石病灶中收集最常见的细菌大肠杆菌的差异细胞蛋白质组图谱。与尿源性细菌相比，病灶源性细菌有 5 种蛋白质含量较低，参与碳水化合物和 DNA/蛋白质代谢，而两种蛋白质含量较高的蛋白质参与应激反应。有趣的是，大肠杆菌的差异细胞蛋白质组伴随着一些表型差异[ 59 ]。此外，将从结石形成者的尿液中分离出的大肠杆菌与从无结石的 UTI 患者中分离出的大肠杆菌进行比较 [ 60 ]。基于凝胶的蛋白质组学鉴定了九种差异表达的蛋白质。其中，延伸因子-Tu (EF-Tu) 是最丰富的蛋白质，在从结石形成者尿液中分离的大肠杆菌中含量高出 2 倍。60 ]。该研究还证明了细菌 EF-Tu 对肾结石形成的促进作用。没有细胞透化的免疫荧光染色显示，与从没有结石的 UTI 患者中分离的大肠杆菌相比，从结石形成者尿液中分离的大肠杆菌具有更高的表面 EF-Tu 表达水平。此外，来自结石形成者尿液的细菌外膜囊泡 (OMV) 对 CaOx 结晶、生长和聚集的促进活性显着大于从无结石尿路感染患者中分离出的细菌外膜囊泡 (OMV)。有趣的是，这些促进作用可以通过使用特异性抗 EF-Tu 抗体中和来改善，从而增强大肠杆菌的促进作用EF-Tu 对 CaOx 肾结石形成过程的影响 [ 60 ]。

以前，结石基质蛋白的分析是通过使用 2D-PAGE [ 61 ] 或 SDS-PAGE， 然后对已知的尿蛋白进行免疫印迹 [ 62 ] 进行的。2008 年，陈等人[ 63 ] 应用蛋白质组学表征结石基质蛋白质组。将 10 例患者采集的 CaOx 结石磨碎，使用含有 5% β-巯基乙醇和 2% SDS 的提取缓冲液从结石粉中提取结石基质蛋白 [ 63 ]。提取的蛋白质的 SDS-PAGE 仅发现三个蛋白质条带，分子大小约为 10、14 和 27 kDa。基于 MS 的分析共鉴定了 11 种蛋白质（四种来自 10-kDa 条带，三种来自 14-kDa 条带，四种来自 27-kDa 条带）[ 63]。这些低分子量蛋白主要是钙结合蛋白（如 S100 蛋白和钙颗粒蛋白）和免疫细胞相关蛋白（如白细胞弹性蛋白酶前体和中性粒细胞防御素 3 前体）[ 63 ]。

基于蛋白质组学的结石基质蛋白鉴定以及使用生物信息学工具进行的基因本体分类表明，大多数结石基质蛋白都参与了炎症过程 [ 64 , 65 ]。Witzmann等人在 2016 年报道了一组非常大的 CaOx 结石基质蛋白[ 66 ]。无标记定量蛋白质组学显示共有 1,059 种蛋白质被鉴定和量化。这些蛋白质参与了多种病理过程，包括免疫反应、炎症、损伤和组织修复 [ 66 ]。另一项研究采用自上而下和自下而上的方法来识别来自不同结石类型的结石基质蛋白 [ 67]。共鉴定出 142 种蛋白质，其中 21 种来自自上而下，133 种来自自下而上方法（注意 12 种重叠）。主要成分包括与炎症反应有关的中性粒细胞防御素 1、蛋白质 S100-A8 和 S100-A9 [ 67 ]。此外，使用强阳离子交换柱 [ 68 ] 或强阴离子交换柱 [ 69 ] 对结石基质蛋白进行分级分离，然后进行 CaOx 晶体测定以及基于蛋白质组学的蛋白质鉴定，揭示了结石基质蛋白表现出抗成石作用活动。这种方法还揭示了七种在结晶抑制中起作用的新型结石基质蛋白 [ 70 ]。

最近，使用无标记光谱计数 MS/MS [ 71 ]对 CaOx 结石基质蛋白进行了另一项蛋白质组分析。将相对蛋白质丰度与早期报道的结石形成者的尿蛋白质组进行比较 [ 54 ]。数据显示，高丰度的尿蛋白，如白蛋白和尿调节素，在结石基质中的丰度相对较低，这表明它们被非选择性地掺入结石基质中 [ 71 ]。有趣的是，五种蛋白质（包括血红蛋白 β 链、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶 2、骨桥蛋白、凝血酶原和维生素 K 依赖性蛋白 Z）在结石基质中显示出相对丰富或富集。此外，数据还表明，高阴离子（pII> 9) 蛋白质在结石基质中富集 [ 71 ]。这些数据表明这些蛋白质选择性地掺入到结石基质中。它们可能在肾结石形成中起主要作用。请注意，蛋白质成分的种类和数量被认为在各个结石之间存在很大差异 [ 72 ]。

细胞蛋白质组变化的信息有助于研究疾病病理学的潜在机制，从而可能导致发现治疗或保护策略。在肾结石研究中，报道了 COM 晶体暴露对远端肾小管上皮细胞（MDCK 细胞）的细胞蛋白质组的影响 [ 73 , 74 ]。在无毒剂量（100 µg 晶体/ml 培养基）下，细胞在接触晶体 48 小时后没有细胞毒性或死亡迹象 [ 73]。2D-PAGE 和 Sypro Ruby 荧光染色显示 20 种显着改变的蛋白质（15 种增加和 5 种减少的蛋白质）响应于 COM 晶体暴露。Q-TOF MS 和 MS/MS 鉴定表明，COM 晶体诱导了载体蛋白、伴侣蛋白、代谢酶、结构蛋白、RNA 结合蛋白和参与 DNA 复制、转录、信号转导、蛋白质生物合成和生长调节的蛋白质的改变[ 73 ]。在较高剂量（1,000 µg/ml）下，表现出明显的细胞毒性作用 [ 74 ]。通过 Q-TOF MS 和 MS/MS 分析，共鉴定出 50 种显着改变的蛋白质。有趣的是，受 COM 诱导的细胞毒性影响的最常见的蛋白质类别是代谢酶和细胞结构蛋白 [ 74 ]。这些差异表达的蛋白质被进一步纳入蛋白质-蛋白质相互作用网络分析[ 75 ]。结果表明，细胞毒性剂量的 COM 晶体诱导蛋白质的改变，主要涉及细胞完整性、连接复合物、细胞增殖、伤口愈合、氧化应激和线粒体功能 [ 75]。功能验证发现，COM 诱导的细胞毒性伴随着细胞内 ATP 产生的增强、紧密连接完整性的缺陷和伤口愈合活性的缺陷 [ 75 ]。

蛋白质组学还用于研究 2 mM 草酸盐和 200 µg/ml COM 晶体在受损的近端肾小管上皮细胞（HK-2 细胞）中的蛋白质组变化 [ 76 ]。2D-PAGE 和 LC-ESI MS/MS 显示 9 个增加和 3 个减少的蛋白质在能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、蛋白质合成、细胞运动和 Ca 2+通道调节中发挥作用 [ 76 ]。最近，使用基于串联质量标签 (TMT) 的定量蛋白质组学结合生物信息学分析，获得了暴露于从肾结石粉碎的 COM 粉末晶体中的 HK-2 细胞的蛋白质组变化 [ 77]。数据表明 1,141 种差异表达的蛋白质通常在调节肌动蛋白细胞骨架组装、紧密连接和粘着斑方面发挥作用 [ 77 ]。有趣的是，人肾结石基质蛋白可以预防 COM 晶体暴露引起的肾细胞损伤 [ 70 ]。用 COM 晶体处理的肾细胞的等压标签相对和绝对定量 (iTRAQ) 分析显示 12 种上调蛋白，主要参与细胞粘附和 41 种下调蛋白，其中大部分参与炎症反应 [ 70 ]。然而，这些蛋白质的改变水平受到与石基质蛋白共同处理的影响[ 70]。结石基质蛋白的潜在保护作用机制仍然未知，值得进一步阐明。

除细胞蛋白质组外，还研究了受 COM 晶体影响的亚细胞蛋白质组。Chaiyarit等人研究了暴露于非细胞毒性剂量 COM 晶体的 MDCK 细胞线粒体蛋白质组的变化。[ 78 ]。在这项研究中，使用差速离心技术分离线粒体。通过 2D-PAGE、Q-TOF MS 和 MS/MS 分析鉴定了 15 种显着改变的线粒体蛋白，包括那些有助于代谢、细胞结构、细胞周期调节、离子转运和信号转导的蛋白。此外，功能分析证实 COM 晶体增强了线粒体蛋白的氧化修饰 [ 78 ]。

对于 COD 晶体的反应，来自暴露于 100 µg/ml 晶体的肾上皮细胞的细胞蛋白的 2D-PAGE 显示 11 种显着改变的蛋白质（5 种减少和 6 种增加的蛋白质）[ 79 ]。Q-TOF MS 和 MS/MS 鉴定出这些改变的蛋白质与代谢和细胞结构的调节有关 [ 79 ]。除了这些改变的蛋白质之外，COD 晶体诱导的糖蛋白水平的变化也得到了表征 [ 80 ]。在后一项研究中，细胞蛋白通过 2D-PAGE 分离。SYPRO Ruby 荧光染料用于总蛋白染色，而 Pro-Q Emerald 荧光染料用于糖蛋白染色 [ 80]。有 16 种差异表达的糖蛋白参与了多个生物学过程。有趣的是，在维持细胞完整性中起作用的肌动蛋白相关蛋白 3 (ARP3) 的糖型减少了，而在调节细胞间解离中起作用的其他三种蛋白质的糖型增加了，表明细胞解离和减弱由 COD 晶体引起的细胞完整性 [ 80 ]。

随后进行了比较由 COM 与 COD 晶体和低剂量 (100 µg/ml) 与高剂量 (1000 µg/ml) 引起的 MDCK 细胞的细胞蛋白质组数据集变化的综合分析 [ 81 ]。数据表明，COM 晶体比 COD 晶体引起更大的变化，并且高剂量比低剂量的相同晶体类型改变的蛋白质数量更多 [ 81 ]。有趣的是，组间差异表达有一些重叠，但在所有条件下都没有发现共同的改变蛋白质，这表明对晶体种类和剂量的特异性反应[ 81 ]。

高钙尿和高草酸尿被公认为 CaOx 肾结石病的危险因素。研究了由于高钙条件而改变的 MDCK 细胞的细胞蛋白质组谱 [ 82 ]。基于 2D-PAGE 的比较蛋白质组学研究，随后对细胞蛋白质进行 MS/MS 鉴定，揭示了 20 mM CaCl 2处理 72 小时诱导的 20 种显着改变的蛋白质 [ 82 ]。这些改变的蛋白质参与了各种生物过程，包括钙结合。其中，已知的钙结合蛋白膜联蛋白 A1 的增加与 COM 晶体细胞粘附的增加有关 [ 82 ]。类似地，MDCK 细胞在含 20 mM Na2C2O4 的培养基中培养 72 小时的细胞蛋白的 2D-PAGE 显示与对照相比有 14 种差异表达的蛋白质 [83]。其中，α-烯醇化酶表达的增加有助于增加 COM 晶体细胞粘附。此外，这些显着改变的蛋白质与对压力的反应、能量产生以及代谢和转录的调节有关[83]。

通过研究高剂量尿酸引起的肾上皮细胞蛋白质组的变化，研究了高尿酸尿症和 CaOx 肾结石形成的关联 [ 84 ]。细胞在含 3.5 mM 尿酸的培养基中孵育后，22 种蛋白质的水平发生了变化。尿酸处理引起的蛋白质改变伴随着 COM 晶体细胞粘附、细胞迁移活性和细胞内 ATP 产生的增加 [ 84 ]。有趣的是，尿酸诱导的顶膜部分热休克蛋白 (HSP) 70 kDa (HSP70) 和 HSP90 的上调导致细胞的 COM 晶体结合能力增加，这种能力可以被 HSP70 的特异性抗体阻断和HSP90 [ 84]。这些数据加强了高尿酸尿症与 CaOx 肾结石形成之间的关系，并可能解释此类相关疾病的潜在机制。

此外，蛋白质组学被用于研究细胞对可能影响肾结石形成的激素的反应。基于男性肾结石发病率和患病率高于女性这一事实，研究了肾上皮细胞对性激素反应的蛋白质组学特征。来自 20 nM 睾酮处理的 MDCK 细胞的细胞蛋白的 2D-PAGE 显示与对照相比有九种差异表达的蛋白质 [ 85]。通过 nanoLC-ESI-Qq-TOF MS/MS 蛋白质鉴定后的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，数据表明上调的 α-烯醇化酶在该模型中具有重要作用。使用晶体细胞粘附试验的功能分析表明，细胞的 COM 晶体粘附能力增加，伴随着睾酮诱导的 α-烯醇化酶上调，表明睾酮促进男性肾结石形成的活性 [ 85 ]。为了证实这一机制，广泛用于睾酮相关疾病的药物非那雄胺通过降低表面 α-烯醇化酶的表达并最终降低 COM 晶体细胞粘附来改善睾酮在 MDCK 细胞中的结石促进作用 [ 86 ] .

此外，还研究了女性性激素、雌激素对 MDCK 细胞的影响 [ 87 ]。共观察到由 20 nM 17β-雌二醇处理一周引起的 58 种差异表达蛋白。从蛋白质-蛋白质相互作用网络分析中检索到的数据表明，这些差异表达的蛋白质有助于结合和受体活性、代谢过程、细胞迁移和愈合。雌激素处理导致表面膜联蛋白 A1 和 α-烯醇化酶的表达降低，导致 COM 晶体细胞粘附降低。此外，功能分析表明，雌激素降低了细胞内 ATP 的产生，促进了细胞迁移和愈合，这可能是肾结石形成过程中的保护机制 [ 87 ]。

CaOx 晶体粘附在上皮细胞表面是肾结石形成的基本步骤之一。位于肾小管上皮细胞顶端表面的具有与COM晶体结合能力的蛋白质可作为晶体受体。Fong-ngern等人[ 88 ] 建立了一种剥离方法，该方法是从上皮细胞中分离和纯化顶膜的简单有效的方法。这种方法导致进一步大规模识别潜在的 COM 晶体受体 [ 89]。通过这种剥离方法纯化的顶膜蛋白与COM晶体一起孵育过夜。去除未结合的蛋白质后，通过 Q-TOF MS 和 MS/MS 分析洗脱和鉴定剩余的 COM 晶体结合蛋白。在这个初始阶段，有 96 种蛋白质被确定为潜在的 COM 晶体受体 [ 89 ]。这些发现为后续研究COM晶体受体的表征提供了很大的帮助。

膜联蛋白 A2 是一种被鉴定为潜在的 COM 晶体受体的蛋白质 [ 89 ]。使用针对膜联蛋白 A2 的特异性抗体阻断细胞表面上的膜联蛋白 A2，通过蛋白质中和验证蛋白质组数据，导致晶体细胞粘附明显降低 [ 89 ]。有趣的是，膜联蛋白 A1 的表达因高钙条件而增强 [ 82 ]，但被咖啡因降低 [ 90 ]，咖啡因是一种主要的生物活性化合物，越来越多的证据表明它可以防止肾结石的形成 [ 91]。随后的功能研究证实了另一种潜在的 COM 晶体受体是 α-烯醇化酶。如上所述，基于凝胶的定量蛋白质组学显示高草酸增强的 α-烯醇化酶表达 [ 83 ]。免疫荧光染色和蛋白质印迹分析成功证实了高草酸诱导的细胞表面α-烯醇化酶表达的增加。此外，晶体细胞粘附测定以及使用针对 α-烯醇化酶的特异性抗体进行中和表明，表面 α-烯醇化酶的中和显着降低了肾上皮细胞的高草酸增强的 COM 晶体结合能力 [ 83]。此外，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 (EGCG) 可降低肾上皮细胞的表面 α-烯醇化酶表达和 COM 晶体粘附能力 [ 92 ]，这是一种常见于绿茶叶中的植物多酚，具有越来越多的预防肾结石的证据 [ 93、94 ]。_ 进一步的研究证实了 α-烯醇化酶与 COM 的选择性结合，而不是其他类型的晶体，特别是在 {121}、{100} 和 {010} 晶面 [ 95 ]。

除了膜联蛋白 A2 和 α-烯醇化酶外，HSP90 作为 COM 晶体受体的作用通过使用针对 HSP90 的特异性抗体的蛋白质印迹得到证实 [ 96 ]。表面 HSP90 的中和显着降低了晶体细胞粘附以及晶体内化到肾细胞中 [ 96 ]。通过串联亲和纯化 (TAP) 进行 HSP90 及其相互作用蛋白伙伴的表征，然后进行 Qq-TOF MS/MS 鉴定 [ 97]。在该复合物中共鉴定出 33 种蛋白质，包括四种形式的 HSP90 和先前鉴定的 COM 晶体受体（即 α-微管蛋白、β-肌动蛋白、钙蛋白酶-1、HSP70 和波形蛋白）。使用小干扰 RNA (siRNA) 敲除 HSP90 会导致这些已识别蛋白质的表达水平发生变化，并显着降低晶体细胞粘附 [ 97 ]。

此外，质膜 Ca 2+ -ATP 酶 (PMCA) 是一种位于质膜以调节 Ca 2+转运的钙调蛋白依赖性钙 ATP 酶，已被大规模蛋白质组学研究确定为 COM 晶体受体 [ 89 ]。使用针对 PMCA2 的特异性抗体进行的免疫荧光染色显示，在晶体与顶膜蛋白孵育后，COM 晶体表面上 PMCA2 蛋白的荧光信号，然后是剧烈洗涤 [ 98 ]。此外，晶体细胞粘附试验和晶体内化试验表明，单克隆抗 PMCA2 抗体阻断表面 PMCA2 会导致粘附和内化的晶体数量减少 [ 98]。这些数据加强了 PMCA2 作为肾小管细胞表面 COM 晶体受体的作用。

使用各种大小的 COM 晶体进行晶体蛋白结合测定，然后通过 MS/MS 分析进行蛋白质鉴定，结果表明 COM 结合蛋白具有大小特异性 [ 99 ]。数据表明，晶体结合蛋白与较大的 COM 晶体结合时具有更多的正净电荷，而与较小的 COM 晶体结合时，它们具有更多的负净电荷 [ 99 ]。与其他尺寸相比，从最大的 COM 晶体（长度>80 µm）中洗脱的晶体结合蛋白具有最大数量的潜在 COM 晶体受体，这些受体是从先前的大规模蛋白质组学研究中确定的 [ 89 ]。此外，从之前的另一项大规模蛋白质组学研究中鉴定出的草酸盐结合蛋白的数量 [ 100] 在结合到最大 COM 晶体上的一组蛋白质中最大 [ 99 ]。最大数量的已知 COM 晶体受体和草酸盐结合蛋白可以解释大 COM 晶体粘附到肾小管细胞上的最高能力。此外，这些数据表明，不同大小的 COM 晶体优先或选择性地结合在沿肾单位的不同肾小管节段的细胞表面上。

为了解决炎症反应和肾结石疾病之间的关联，蛋白质组学被用于研究免疫细胞的蛋白质组。通过基于凝胶的蛋白质组学检查了 100 µg/ml COM 晶体处理后单核细胞的细胞蛋白质组变化 [ 101 ]。Q-TOF MS 和 MS/MS 分析确定了 22 种差异表达的蛋白质，这些蛋白质参与各种细胞过程并可能导致随后的炎症反应 [ 101 ]。此外，同样的方法用于研究暴露于 100 µg/ml COM 晶体的巨噬细胞，并鉴定出 18 种差异表达的蛋白质 [ 102]。蛋白质网络分析发现了一组上调蛋白质的相互作用，包括 HSP90 和 β-肌动蛋白。免疫荧光染色成功证实了两种蛋白质的共定位，特别是在 COM 晶体周围的吞噬体膜上，表明它们在吞噬体形成中的重要作用 [ 102 ]。验证研究表明，通过 siRNA 降低 HSP90 的表达导致吞噬体标志物 Rab5 的下降，同时伴随着吞噬活性的降低 [ 102 ]。

随后，ELISA 揭示了来自 COM 处理的巨噬细胞的分泌产物中转化生长因子 β (TGF-β)（一种多效性细胞因子）水平升高 [ 103 ]。此外，使用蛋白质组学方法在无血清培养基中用 100 µg/ml COM 晶体处理 16 小时的单核细胞中研究了分泌组的变化 [ 104 ]。通过 Q-TOF MS 和 MS/MS 分析，共鉴定出 18 种水平显着改变的分泌蛋白，其中 14 种增加和 4 种减少，它们在细胞结构、DNA/RNA 结合、信号转导、代谢、运输、压力中发挥作用反应和炎症反应 [ 104 ]。

外泌体是从细胞中释放出来的纳米级 EV，包含各种细胞内容物（例如蛋白质、RNA 和 DNA）[ 105 , 106 ]。外泌体在细胞通讯、免疫反应和炎症中的作用已在多种疾病中得到广泛研究 [ 105–107 ]。辛格托等人。[ 108 ] 从暴露于 COM 的巨噬细胞的培养上清液中分离出外泌体。基于凝胶的蛋白质组学发现六种显着改变的外泌体蛋白主要参与免疫反应，包括增加的炎性体激活标志物白细胞介素-1β (IL-1β) [ 108]。这些 COM 处理的外泌体可以触发单核细胞活化、迁移和炎性细胞因子 (IL-8) 的产生。此外，COM 处理的外泌体还刺激 T 细胞迁移和巨噬细胞吞噬活性 [ 108 ]。随后，应用无凝胶、无标记的定量蛋白质组学来确定来自暴露于 COM 晶体的巨噬细胞的改变的外泌体蛋白 [ 109]。在 COM 处理的外泌体中检测到 26 种参与多种生物过程的显着改变的蛋白质，包括免疫反应和细胞外基质分解。功能分析通过增强肾细胞产生的 IL-8 和激活中性粒细胞迁移证实了这些 COM 处理的外泌体参与炎症反应。COM 处理的外泌体也可能在触发 COM 晶体侵入肾间质中发挥作用，因为涂有来自暴露于 COM 的巨噬细胞的外泌体的 COM 晶体显示通过细胞外基质 (ECM) 迁移室的晶体侵入增加 [ 109 ]。

最近报道了来自结石形成者和正常受试者尿液的外泌体的定量蛋白质组学[ 110 ]。结果显示，正常尿液外泌体中有 831 种蛋白质，结石形成者中有 879 种蛋白质。其中，67种蛋白质在两组之间存在显着差异。使用 DAVID ( https://david.ncifcrf.gov) 数据库进行功能富集分析发现，不同的尿外泌体蛋白主要参与先天免疫反应、细菌防御机制和钙结合特性 [ 110 ]。这些数据可能暗示肾结石发病过程中通过尿外泌体货物的免疫机制和致病事件。

还研究了来自肾上皮细胞的分泌物。肾细胞在transwell系统中培养成为极化上皮细胞。与 100 µg/ml COM 晶体在无血清培养基中孵育 20 小时后，收集并分析下室（定义为基底外侧分泌组）中的上清液 [ 111 ]。2D-PAGE 和 Q-TOF MS/MS 分析显示六种显着改变的蛋白质被鉴定为 14-3-3 ε、α-烯醇化酶、α-微管蛋白 2、肌动蛋白、磷酸甘油酸变位酶 1 和泛素激活酶 E1。得益于先前建立的晶体侵入检测 [ 12]，改变的分泌蛋白的功能验证，特别是通过 COM 处理增加的 α-烯醇化酶，表明从极化肾上皮细胞的基底外侧区室分泌的改变的蛋白质增强了 COM 晶体的侵袭和单核细胞通过 ECM 迁移室的迁移 [ 111 ]。综上所述，所有这些数据都强调了来自肾细胞和单核细胞/巨噬细胞的分泌组和 EV 在肾结石疾病炎症反应中的重要作用。

据 PubMed 称，自 2008 年以来，蛋白质组学已被引入肾结石研究。此后，蛋白质组学方法已应用于肾结石疾病的多个方面（图 2）。结石形成者与健康个体的尿液蛋白质组谱的比较，提供了对肾结石形成潜在调节剂的鉴定（见第 3 节）。随后，体外晶体测定已被开发并用于确认已鉴定蛋白质对结石形成过程的调节活性。此外，检查了治疗后尿液蛋白质组谱的变化。此外，从导尿管中分离出的细菌的蛋白质组分析已经解决了尿路感染在肾结石发病机制中的致病作用（见第 3 节）。使用蛋白质组学方法和生物信息学分析对结石基质蛋白的表征提供了结石形成过程中细胞和细胞外过程的提示，特别是晶体调节和炎症反应（见第 4 节）。

事实上，蛋白质组学主要用于表征模拟 CaOx 肾结石/尿石症条件的干预后细胞蛋白质组的变化，包括暴露于各种剂量的 COM 和 COD 晶体、高钙、高草酸盐或高尿酸环境。此外，还检查了亚细胞蛋白质组的改变（见第 5 节）。COM 晶体结合蛋白的大规模鉴定导致了几项子序列研究，这些研究证实了肾小管上皮细胞顶膜上的几种表面蛋白作为 COM 晶体受体的作用。已经做出了很多努力来研究影响这些蛋白质表达的因素（见第 6 节和第7节））。最后，蛋白质组学方法已应用于研究来自免疫细胞的细胞蛋白质组、分泌组和 EV 的变化，以解决肾结石疾病中的炎症反应。

根据本综述总结的证据，无论方法和标本的类型如何，多组蛋白质组学数据都表明应激（特别是氧化应激）和炎症反应与肾结石疾病有关。连同来自细胞、亚细胞和细胞外研究的其他发现，这些数据有助于更好地了解肾结石的发病机制，并提供可能有助于将数据进一步转化为临床的经验。

与其他领域类似，蛋白质的分离和纯化方法对于后续的表达和功能分析很重要。由于高丰度蛋白质可能会掩盖低丰度但重要蛋白质的鉴定，因此与使用完整或未分级样品相比，尿液、结石基质和细胞蛋白质的分级肯定提供更多信息。在鉴定或表征蛋白质之前选择适当的方法来分离感兴趣的部分将有助于获得有价值和可靠的结果。迄今为止，大多数基于蛋白质组学的肾结石研究主要产生已鉴定蛋白质的表达数据，而不是它们的功能参与。因此，需要进一步的功能分析来确定它们在肾结石发病机制中的作用[112 ]。

生物信息学门户的最新发展和改进使研究人员能够在生物信息学分析的指导下分析肾结石蛋白质组学数据（尤其是在过去 5 年中获得的数据）以进行后续功能研究，以确定已鉴定蛋白质在致病机制中的可能作用肾结石疾病 [ 112 ]。可以通过使用各种技术（例如抗体中和、siRNA 或 shRNA 敲低和蛋白质过表达）操作蛋白质来进一步研究特定蛋白质的精确作用。此外，最近建立了基于网络的肾结石调节剂集合，即 StoneMod（肾结石调节剂数据库）（https://www.stonemod.org ）[ 113]。该工具为所有寻找一站式资源以获取肾结石调节蛋白的所有必要信息的研究人员提供了一个用户友好且可免费访问的数据库 [ 113 ]。

肾结石蛋白质组学数据不断为更好地了解疾病的发病机制带来重要信息。因此，将这些从肾结石蛋白质组学研究中获得的基础研究数据转化为临床实践将是一项令人难以置信的挑战。成功的翻译可以改善医疗保健，特别是早期疾病诊断、肾结石分型、新结石和/或复发结石的风险评估以及预防策略。然而，仍然存在许多研究空白，需要进一步阐明以实现知识，然后才能转化为临床。

根据迄今为止的可用数据，最可行的应用似乎是尿液蛋白质组学，用于探索重要的结石调节剂（抑制剂或促进剂）。获得的信息将有助于早期发现无症状病例，及时预防症状、并发症和新结石形成。此外，这些调节剂可能成为未来通过药物成功治疗和预防肾结石疾病的新治疗靶点。结石调节剂的知识将有助于监测药物或膳食补充剂以提高抑制剂的水平，同时降低促进剂的水平。例如，在体外研究中观察到石灰粉的抗岩石作用 [ 55]。随后的临床试验使用基于蛋白质组学的人类尿液分析提供了支持性证据，即接受石灰粉补充剂的患者的结石抑制蛋白水平增加 [ 56 ]。

此外，基于蛋白质组学的 COM 晶体受体表征为药物发现提供了宝贵的信息（即阻止晶体细胞粘附和相互作用，从而在结石开始形成之前的早期阶段消除结石病灶）。最近，蛋白质组学和其他技术已被应用于研究物质（合成化学品或纯化的天然产物）对肾结石预防的影响 [ 90–94 , 114–116 ]。与其他领域一样，肾结石病的体外蛋白质组学研究可能与了解该疾病的相关性有限，因为有混杂因素会影响人体疾病的发病机制。此外，大多数这些在体外研究只关注少数细胞类型，例如上皮细胞和单核细胞/巨噬细胞。然而，位于肾脏的其他细胞类型也可能参与肾结石的发病机制。尽管这些研究大部分是在体外进行的，但获得的数据还是有说服力。蛋白质组学、生物信息学和功能验证的结合将缩小实验室和临床之间的转化差距。

简要介绍了肾结石病（肾结石/尿石症）的背景。

提供了以下方面的更新和最新进展：

尿液蛋白质组学鉴定肾结石调节剂。

结石基质的蛋白质组学。

肾细胞蛋白质组学以确定肾结石形成的机制。

晶体结合蛋白的蛋白质组学以表征 COM 晶体受体。

各种 COM 晶体尺寸上晶体结合蛋白的蛋白质组学。

用于解决肾结石疾病炎症反应的分泌组和 EV 的蛋白质组学。

讨论了肾结石蛋白质组学的前景和未来挑战，特别是临床应用。

来源：医学镜界