摘要：https://www.nature.com/articles/s41564-025-01937-5肠隐窝中存在特定的微生物群，但这些细菌是否以及如何调节肠道干细胞（ISC）或影响结直肠癌（CRC）的发生发展尚不清楚。我们通过在类器官中筛选肠隐窝常驻细菌，发现

研究论文

● 期刊：Nature Microbiology (IF:20.5)

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结果Results

耐辐射不动杆菌产生的吲哚乙酸抑制细胞增殖

我们假设肠隐窝微生物群分泌的产物可能会影响肠道干细胞（ISC）的功能。为了在肠道类器官系统中对此进行研究，我们使用了细菌外膜囊泡（OMV）来探究隐窝细菌产生的成分/代谢物与肠道干细胞之间的潜在相互作用，细菌外膜囊泡能够包裹多种物质。选择外膜囊泡是因为它们很容易进入类器官的管腔，而在与类器官共培养时，细菌实际上无法进入类器官管腔。我们从代表隐窝微生物群中优势细菌进化枝的三个菌种中分离出了外膜囊泡：耐辐射不动杆菌（Acinetobacter radioresistens）、温和不动杆菌（Acinetobacter modestus）和代尔夫特菌（Delftia tsuruhatensis）（图1a），并测试了它们对已建立的小肠类器官的影响。只有耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡抑制了类器官中的细胞增殖，这一点可从5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记细胞数量的减少得到证明（图1b、c）。然而，将纯化的隐窝暴露于耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡后，这些外膜囊泡对类器官的起始频率没有不良影响（扩展数据图1a、b）。耐辐射不动杆菌已被证明，无论是作为植物体内的内生菌，还是作为根际微生物群的一员，都能特异性地产生吲哚乙酸（IAA），从而促进植物的生长和健康。考虑到IAA是一种色氨酸代谢物，有可能调节控制肠道细胞增殖的Wnt信号通路，我们评估了隐窝细菌来源的外膜囊泡中IAA的含量。对外膜囊泡中IAA含量的评估显示，耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡中的IAA含量明显高于其他菌株来源的外膜囊泡（图1d）。与耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡类似，外源性IAA以剂量依赖的方式抑制类器官中的细胞增殖（图1e、f），而且即使在低浓度下也是如此（扩展数据图1c、d）。为了验证IAA是耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡中参与调节类器官增殖的分泌产物这一假设，我们构建了一个突变菌株，即∆trpC耐辐射不动杆菌（扩展数据图1e），该菌株在培养物中（扩展数据图1f）和在外膜囊泡中（扩展数据图1g-i）分泌的IAA水平显著降低。然而，∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡的蛋白质谱与野生型耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡相似（扩展数据图1j）。正如预期的那样，∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡对类器官中的细胞增殖没有影响（图1g、h），这表明耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡是通过IAA来调节类器官中的细胞增殖的。值得注意的是，耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡对肠道类器官中的细胞凋亡没有影响（扩展数据图1k、l），而且其作用与Toll样受体4（TLR4）无关（扩展数据图1m、n）。耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡对细胞增殖的抑制作用并不局限于小肠类器官，因为结肠类器官对耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡也有类似的反应（扩展数据图2a、b）。

图1 | 耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡通过一种依赖吲哚乙酸的途径影响细胞增殖

a. 电子显微镜图像显示耐辐射不动杆菌（Ar）、温和不动杆菌（Am）和代尔夫特菌（Dt）释放外膜囊泡（OMV，如黑色箭头所示），以及从这些菌株中纯化得到的外膜囊泡。

b. 对暴露于外膜囊泡（每孔0.5微克）24小时的小肠类器官进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色（绿色）。（上方：荧光通道图像。下方：荧光通道与明场通道合并的图像。）

c. 对暴露于溶媒组和外膜囊泡组的类器官中掺入EdU的细胞进行定量分析。计数的类器官数量分别为：14个（溶媒组，Veh）、8个（耐辐射不动杆菌组，Ar）、13个（温和不动杆菌组，Am）和11个（代尔夫特菌组，Dt）。

d. 对从耐辐射不动杆菌、温和不动杆菌和代尔夫特菌中纯化得到的外膜囊泡中的吲哚乙酸（IAA）进行定量分析。样本数量分别为：7个（耐辐射不动杆菌组，Ar）、7个（温和不动杆菌组，Am）和5个（代尔夫特菌组，Dt）。

e. 对暴露于不同浓度的耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡（Ar-OMVs）或吲哚乙酸（IAA）24小时的肠道类器官进行EdU染色。

f. 对暴露于溶媒、外膜囊泡或吲哚乙酸的类器官中掺入EdU的细胞进行定量分析。计数的类器官数量（从左（溶媒组，Veh）到右（1毫摩尔吲哚乙酸组，1 mM IAA））分别为：29个、30个、31个、22个、23个和25个。

g. 对暴露于耐辐射不动杆菌或∆trpC耐辐射不动杆菌突变株来源的外膜囊泡24小时的类器官进行EdU染色。

h. 对暴露于溶媒或外膜囊泡的类器官中掺入EdU的细胞进行定量分析。评估的类器官数量分别为：17个（溶媒组，Veh）、11个（耐辐射不动杆菌组，Ar）和16个（∆trpC耐辐射不动杆菌组）。

i. 基于荧光原位杂交（FISH）技术对小鼠、蝙蝠和人类结肠隐窝中耐辐射不动杆菌的定殖情况进行定量分析（每组n = 5）。

j. 上方：使用耐辐射不动杆菌特异性探针通过荧光原位杂交技术检测小鼠、蝙蝠和人类结肠隐窝中耐辐射不动杆菌的定殖情况。白色箭头指示耐辐射不动杆菌的定殖位置。下方：含有耐辐射不动杆菌（红色）的单个隐窝。

k. 对暴露于耐辐射不动杆菌、∆trpC耐辐射不动杆菌或吲哚乙酸来源的外膜囊泡24小时的人类结肠类器官进行EdU染色。

l. 对暴露于外膜囊泡的人类结肠类器官中掺入EdU的细胞进行定量分析。计数的类器官数量分别为：20个（溶媒组，Veh）、20个（耐辐射不动杆菌组，Ar）、27个（∆trpC耐辐射不动杆菌组）和10个（1毫摩尔吲哚乙酸组，1 mM IAA）。

数据以平均值±标准误（mean±s.e.m.）表示。对于c、d、f、h、i和l，P值使用方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验进行计算，若P

我们比较了耐辐射不动杆菌在多种哺乳动物宿主（包括小鼠、人类以及寿命较长且被认为具有抗癌能力的野生蝙蝠）结肠隐窝中的定殖情况，以确认其生态位特异性。我们发现，与实验小鼠以及人类结直肠癌患者肿瘤旁的健康组织相比，野生蝙蝠的结肠隐窝中耐辐射不动杆菌大量富集（图1i、j和扩展数据图2c）。这一发现，再加上先前有关耐辐射不动杆菌在野生啮齿动物结肠隐窝中普遍存在以及不动杆菌属物种在人类结肠隐窝中存在的报道，表明这种对特定生态位的趋向性在某些哺乳动物物种中可能是保守的。为了确认我们在小鼠类器官中的研究结果是否能应用于人类类器官，我们使用一名结直肠癌患者肿瘤旁的健康、非肿瘤结肠组织构建了人类结肠类器官（补充表1）。耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡以依赖吲哚乙酸（IAA）的方式抑制了人类结肠类器官中的细胞增殖（图1k、l）。

耐辐射不动杆菌产生的吲哚乙酸下调肠道Wnt信号通路A.

由于肠道上皮细胞的增殖是肠道干细胞（ISC）活动的结果，我们利用来自一种基于非杂色报告基因的体内谱系追踪小鼠品系（Lgr5-2A-CreERT2-R26-tdTomato 21）的类器官，分析了耐辐射不动杆菌产生的吲哚乙酸（IAA）是否直接作用于肠道干细胞。与暴露于溶媒或∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡（OMV）的类器官相比，已建立的暴露于耐辐射不动杆菌外膜囊泡24小时的小肠类器官和结肠类器官中，表达番茄红素（Tomato）的细胞百分比均显著降低（图2a-c和扩展数据图3a、b）。外源性吲哚乙酸的作用与耐辐射不动杆菌外膜囊泡的作用相当（图2a-c和扩展数据图3a、b）。在来自Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠的类器官中，用DiD标记的耐辐射不动杆菌外膜囊泡与用绿色荧光蛋白（GFP）标记的肠道干细胞的共定位表明，外膜囊泡与肠道干细胞之间存在直接相互作用（扩展数据图3c），这与之前关于肠道干细胞与外膜囊泡相互交流的报道一致。此外，我们观察到，在暴露于耐辐射不动杆菌外膜囊泡或吲哚乙酸的类器官中，经典的Wnt-β-连环蛋白信号通路靶基因，如c-myc、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和Ascl2的表达降低（图2d、e和扩展数据图3d）。Wnt-β-连环蛋白信号通路的另一个靶基因是Axin2，它常被用作Wnt-β-连环蛋白信号通路激活的报告基因。利用来自Wnt-β-连环蛋白信号通路报告基因小鼠品系（Axin2-2A-EGFP小鼠）的类器官，我们还观察到，与暴露于溶媒或∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡的类器官相比，暴露于耐辐射不动杆菌外膜囊泡的类器官中Axin2阳性细胞的百分比降低（图2f、g）。综上所述，这些发现表明，耐辐射不动杆菌产生的吲哚乙酸抑制肠道Wnt-β-连环蛋白信号通路。

图2 | 耐辐射不动杆菌的外膜囊泡改变肠道干细胞的功能

a. 将来自LGR5-2A-creERT2-R26-tdTomato小鼠的肠隐窝在培养小室载玻片中进行培养。将已建立的类器官暴露于溶媒、耐辐射不动杆菌（Ar）来源的外膜囊泡（OMV）、∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡或吲哚乙酸（IAA）中，随后在追踪番茄红素阳性（Tomato+）细胞之前，用4-羟基他莫昔芬（OHT）处理10小时。

b. LGR5-2A-creERT2-R26-tdTomato小鼠来源的暴露于外膜囊泡或吲哚乙酸的类器官，在4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理10小时后的代表性图像（蓝色为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色；红色为番茄红素（Tomato））。白色箭头所指为番茄红素阳性（Tomato+）细胞。

c. 暴露于耐辐射不动杆菌、∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡或吲哚乙酸24小时的类器官中，番茄红素阳性（Tomato+）细胞的百分比。计数的类器官数量分别为：15个（溶媒组，Veh）、10个（耐辐射不动杆菌组，Ar）、16个（∆trpC耐辐射不动杆菌组）和10个（1毫摩尔吲哚乙酸组，1 mM IAA）。

d、e. 暴露于耐辐射不动杆菌、∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡或吲哚乙酸24小时的类器官中，c-myc（d）和细胞周期蛋白D1（cyclin D1）（e）的信使核糖核酸（mRNA）表达情况（每组n = 5）。

f. 暴露于外膜囊泡或吲哚乙酸的类器官中，Axin2阳性（Axin2+）细胞的百分比。计数的类器官数量分别为：22个（溶媒组，Veh）、25个（耐辐射不动杆菌组，Ar）、17个（∆trpC耐辐射不动杆菌组）和13个（1毫摩尔吲哚乙酸组，1 mM IAA）。

g. Axin2-2A-EGFP小鼠来源的暴露于耐辐射不动杆菌、∆trpC耐辐射不动杆菌来源的外膜囊泡或吲哚乙酸24小时的类器官的代表性图像（蓝色为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色；绿色为Axin2）。

数据以平均值±标准误（mean±s.e.m.）表示。P值使用方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验进行计算，若P

耐辐射不动杆菌抑制肠道肿瘤的发展

图3 | 耐辐射不动杆菌会影响肠道肿瘤的发展

b. 暴露于耐辐射不动杆菌（Ar）外膜囊泡（n = 4）、∆trpC耐辐射不动杆菌外膜囊泡（n = 4）、溶媒（n = 8）或吲哚乙酸（n = 3）后，类球体的起始频率。

c. 所评估的类球体中掺入5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）的细胞情况；样本数量分别为：15个（溶媒组，Veh）、10个（耐辐射不动杆菌组，Ar）、14个（∆trpC耐辐射不动杆菌组）和12个（吲哚乙酸组，IAA）。

d. 类球体在暴露24小时后的EdU染色情况（绿色）。（上方：荧光通道图像。下方：荧光通道与明场通道合并的图像）

e. 人类肿瘤切片培养物在暴露于外膜囊泡或吲哚乙酸24小时后的EdU染色情况（全细胞角蛋白（PanCK）染色为红色；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色为蓝色；EdU染色为黄色）。

f. 处理组或未处理组肿瘤切片（1至5号样本）中增殖细胞的百分比。

g. 对连续10天灌胃给予耐辐射不动杆菌或吲哚乙酸的APCMin/+小鼠的腺瘤情况进行评估。

h. APCMin/+小鼠在暴露于耐辐射不动杆菌（n = 13）、吲哚乙酸（n = 9）或溶媒（n = 17）后，肠道微小腺瘤（大小

i. 大小

j. APCMin/+小鼠小肠的瑞士卷切片。黑色箭头所指为大腺瘤（大小 ≥ 100微米）。

k. APCMin/+小鼠小肠肿瘤中掺入EdU的细胞情况（每组n = 5）。

l. 小肠肿瘤的EdU染色情况（DAPI染色为蓝色；EdU染色为绿色）。

m. 不同处理组的APCMin/+小鼠在无R-脊椎蛋白-1条件下培养的小肠类球体。黑色箭头所指为类球体。

n. APCMin/+小鼠在暴露后类球体的起始频率（溶媒组n = 13，耐辐射不动杆菌组n = 15，吲哚乙酸组n = 10）。

o. APCMin/+小鼠结肠肿瘤与周围区域中耐辐射不动杆菌（Ar）的存在情况（每组n = 5）。

p. 人类结直肠癌（CRC）患者肿瘤与周围区域中耐辐射不动杆菌的存在情况（每组n = 15）。

q. 小鼠肿瘤及癌旁组织中耐辐射不动杆菌的定殖情况。白色箭头所指为耐辐射不动杆菌的定殖位置。

r. 人类结直肠癌患者肿瘤及癌旁组织对中耐辐射不动杆菌的定殖情况。白色箭头所指为耐辐射不动杆菌的定殖位置。

数据以平均值±标准误（mean±s.e.m.）表示。P值使用方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验进行计算，若P

此外，基于荧光原位杂交（FISH）技术，我们观察到，与小鼠和人类的癌旁组织相比，结肠肿瘤中对耐辐射不动杆菌的隐窝特异性检测结果显示其数量减少（图3o-r）。使用耐辐射不动杆菌特异性引物进行的实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）进一步证实了这一趋势，而嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）的数量则保持相似（扩展数据图4p-s）。此外，与无结直肠癌的人相比，结直肠癌患者粪便样本中耐辐射不动杆菌的丰度降低，而嗜黏蛋白阿克曼氏菌的丰度保持不变（扩展数据图4t、u）。令人惊讶的是，小鼠结肠中耐辐射不动杆菌的数量随宿主年龄的增长而减少（扩展数据图4v-x），而在另一种隐窝定居菌——温和不动杆菌（A. modestus）中并未观察到这种现象（扩展数据图4y）。

耐辐射不动杆菌数量的减少会增加肠道干细胞的增殖

为了在保留肠道微生物群的同时清除耐辐射不动杆菌（A. radioresistens），我们分离出了一种耐辐射不动杆菌特异性的裂解性噬菌体（Ar-φ）（图4a-c和扩展数据图5a）。在连续14天每天给小鼠口服Ar-φ后，我们观察到耐辐射不动杆菌阳性隐窝的数量显著减少（图4d-f），并且该菌从肠道管腔中被清除（扩展数据图5b）。我们还用一种抗链霉素且带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的耐辐射不动杆菌突变株定殖经链霉素处理的小鼠，然后让这些小鼠接触Ar-φ（扩展数据图5c、d），并通过GFP染色证实了该菌已被清除（扩展数据图5e）。接下来，我们评估了清除耐辐射不动杆菌对隐窝生态位中吲哚乙酸（IAA）水平的影响，结果发现，与用溶媒处理的小鼠相比，从经Ar-φ处理的小鼠中分离出的隐窝中吲哚乙酸水平显著降低（图4g）。Ar-φ对小鼠体重或小鼠和人类肠道类器官中的细胞增殖均没有不良影响，这确保了其使用的安全性（扩展数据图5f-j）。此外，与用溶媒处理的对照组相比，我们没有观察到接触Ar-φ后的小鼠肠道微生物群组成发生任何实质性变化（扩展数据图5k-n）。

图4 | 噬菌体介导的从隐窝生态位中清除耐辐射不动杆菌会影响干细胞的特性

a. 显示耐辐射不动杆菌特异性噬菌体（Ar-φ）结构的电子显微镜图像。

b. Ar-φ基因组的环形视图。

c. 不同稀释度的耐辐射不动杆菌特异性噬菌体（Ar-φ）的噬菌斑。

d. 对C57BL/6小鼠、Axin2-2A-EGFP小鼠和Lgr5-2A-CreERT2-R26-tdTomato小鼠连续14天灌胃给予溶媒或Ar-φ，并进行评估。

e. 使用耐辐射不动杆菌（Ar）特异性探针进行荧光原位杂交（FISH）染色，结果显示经Ar-φ治疗后，C57BL/6小鼠的结肠隐窝中不存在耐辐射不动杆菌。白色箭头指示耐辐射不动杆菌的定殖位置。

f. 基于荧光原位杂交技术，经Ar-φ治疗后结肠隐窝中耐辐射不动杆菌的存在情况（每组n = 3）。

g. 溶媒处理组或Ar-φ处理组小鼠纯化的结肠隐窝中的吲哚乙酸（IAA）水平（每组n = 6）。

h. 经Ar-φ治疗后小鼠近端结肠中β-连环蛋白的表达情况。

i. 两组小鼠近端结肠中β-连环蛋白的表达情况（每组n = 9）。

j. 右侧：对Axin2-2A-EGFP小鼠经Ar-φ治疗后Axin2阳性细胞的定量分析。左侧：直方图显示经Ar-φ治疗后绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞数量增加（每组n = 6）。

k. 暴露于溶媒或Ar-φ的小鼠结肠卷的多光谱成像（红色为EphB2；黄色为Ki-67；青色为粘蛋白2（muc2）；白色为嗜铬粒蛋白A（chromogranin A）；绿色为E-钙粘蛋白（E-cadherin）；蓝色为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））。白色箭头所指为用相应标记物染色的细胞。

l - p. 对暴露于溶媒或Ar-φ的小鼠结肠中杯状细胞（l）、肠内分泌细胞（m）、EphB2（n）、Ki-67（o）和隐窝深度（p）的定量分析（每组n = 5）。

q. 近端结肠中EphB2的表达情况（每组n = 9）。

r. 两组小鼠近端结肠中EphB2的表达情况。

s. 在给予他莫昔芬后第3天和第5天，暴露于溶媒或Ar-φ的小鼠近端结肠中番茄红素（Tomato）的表达情况（蓝色为DAPI染色；红色为红色荧光蛋白（RFP）染色）。

t. 在给予他莫昔芬后72小时或120小时，沿隐窝-绒毛轴对两组中追踪到的番茄红素阳性（Tomato+）细胞的距离进行评分（每组n = 5）。

数据以平均值±标准误（mean±s.e.m.）表示。P值使用单侧学生t检验进行计算，若P

接下来，我们研究了耐辐射不动杆菌数量的减少是否会影响Wnt信号通路。特异性清除耐辐射不动杆菌后，在耐辐射不动杆菌定殖最多的近端结肠中，β-连环蛋白的表达增加了（图4h、i）。为了证实Wnt-β-连环蛋白信号通路被激活，我们观察到，与对照组相比，在用Ar-φ处理后，从Wnt-β-连环蛋白信号通路报告基因小鼠（Axin2-2A-EGFP小鼠）中分离出的隐窝内，Axin2阳性细胞数量增加了（图4d、j和扩展数据图6a）。两组小鼠结肠中Lgr5阳性肠道干细胞（ISC）的数量相当（扩展数据图6b、c）。耐辐射不动杆菌数量减少后Wnt-β-连环蛋白信号通路发生了改变，这促使我们研究其对结肠细胞增殖和分化的影响。对两组小鼠结肠组织进行的多重免疫组织化学（IHC）成像分析显示，与溶媒对照组相比，经Ar-φ处理的小鼠结肠隐窝中，经典的Wnt-β-连环蛋白信号通路靶基因EphB2的表达升高，随之而来的是表达Ki-67的细胞数量增加（图4k-p）。两组之间杯状细胞、肠内分泌细胞的数量以及隐窝的深度相似（图4k-p）。与对照组相比，经Ar-φ处理的小鼠结肠中，EdU标记的细胞显著增多（扩展数据图6d、e），且EphB2的蛋白表达增加，这进一步证实了上述发现（图4q、r）。这些发现表明，耐辐射不动杆菌的缺失破坏了稳态下Wnt-β-连环蛋白-EphB2信号通路的平衡，导致结肠细胞增殖加剧，而细胞分化则未受影响。为了确定耐辐射不动杆菌对结肠肠道干细胞的直接影响，我们让Lgr5-2A-CreERT2-R26-tdTomato小鼠接触Ar-φ（图4d），并追踪结肠中的细胞谱系。与对照组相比，经Ar-φ处理的小鼠在给予他莫昔芬处理后的第3天和第5天，结肠中表达番茄红素（Tomato）的细胞数量始终更多（图4s、t）。这突出了耐辐射不动杆菌与肠道干细胞之间的相互作用会影响结肠细胞的更新。

耐辐射不动杆菌数量的减少与结直肠癌的发展

为了探究耐辐射不动杆菌数量的减少是否会促进肿瘤发生，我们采用了一种炎症诱导的结直肠癌（CRC）模型，让小鼠接触氧化偶氮甲烷（AOM）和右旋糖酐硫酸钠（DSS）（图5a）。长期的Ar-φ治疗降低了耐辐射不动杆菌的数量（扩展数据图7a），并且对宿主的体重（b.w.）没有不良影响（图5b），但结肠肿瘤的负荷以及较大肿瘤出现的频率都增加了（图5c-e）。对于经AOM-DSS处理的小鼠，Ar-φ处理还增加了在无R-脊椎蛋白-1和Wnt3A的情况下结肠隐窝形成类球体的能力（图5f、g）。对经AOM-DSS处理的小鼠结肠肿瘤进行基于机器学习的多重免疫组织化学（IHC）自动分析（扩展数据图7b）显示，与溶媒对照组相比，Ar-φ处理组肿瘤中β-连环蛋白的表达增加，Ki-67阳性细胞的数量增多（图5h、i）。与对照组相比，Ar-φ处理组结肠肿瘤中β-连环蛋白和Ki-67双阳性细胞的数量要高得多（图5j），这表明异常的Wnt-β-连环蛋白信号通路与肿瘤增殖加剧有关。相比之下，两组中溶菌酶标记、CD3标记或B220标记的免疫细胞数量相当（图5h、i），这表明两组的炎症状态相似。

图5 | 缺乏耐辐射不动杆菌的结肠隐窝易发生肿瘤

a. 小鼠连续2周（每周两次）灌胃给予溶媒或Ar-φ，随后注射氧化偶氮甲烷（AOM），并进行3个周期的右旋糖酐硫酸钠（DSS）暴露和恢复处理。

b. 两组小鼠的体重情况（溶媒组n = 9，Ar-φ组n = 10）。

c. 经AOM-DSS处理的小鼠结肠中的肿瘤发展情况。白色箭头所指为肿瘤。

d. 经AOM-DSS处理的小鼠结肠中肿瘤的数量（溶媒组n = 9，Ar-φ组n = 10）。

e. 经AOM-DSS处理的小鼠结肠中肿瘤的大小（溶媒组n = 9，Ar-φ组n = 10）。

f. 两组小鼠的结肠类球体的存活情况。黑色箭头所指为类球体。

g. 两组小鼠中类球体的起始频率（每组n = 6）。

h. 两组经AOM-DSS处理的小鼠结肠肿瘤的多光谱成像（绿色为β-连环蛋白；白色为Ki-67；黄色为溶菌酶；紫色为CD3；青色为B220；蓝色为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））。白色箭头所指为用相应标记物染色的细胞。

i. 基于机器学习对结肠肿瘤中Ki-67、CD3、溶菌酶、B220和β-连环蛋白标记的细胞进行自动细胞表型分析（每组n = 5）。

j. 结肠肿瘤中β-连环蛋白和Ki-67双阳性细胞的情况（每组n = 5）。

k. Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl小鼠在cre激活后连续2周每天灌胃给予溶媒、Ar-φ或Ar-φ与伊马替尼的组合，并评估肿瘤起始情况。

l. 左侧：三组小鼠中经β-连环蛋白染色的微小腺瘤。右侧：放大后的图像。黑色箭头所指为微小腺瘤。

m. 三组小鼠中微小腺瘤的定量分析（溶媒组n = 14，Ar-φ组n = 13，Ar-φ + 伊马替尼组n = 12）。

n. Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl小鼠在cre激活前暴露于溶媒或Ar-φ 2周，随后再连续2周每天灌胃给予溶媒或Ar-φ。

o. 小鼠各组中微小腺瘤的定量分析（每组n = 8）。

p. 左侧：两组小鼠中经β-连环蛋白染色的微小腺瘤。右侧：放大后的图像。黑色箭头所指为微小腺瘤。

P值使用单侧学生t检验、方差分析结合Tukey多重比较检验或双向方差分析结合Sidak多重比较检验进行计算，若P

由于在AOM-DSS模型中，耐辐射不动杆菌数量的减少促进了肿瘤发生，这表明耐辐射不动杆菌具有保护作用，能够抑制结肠肿瘤的起始。我们转而使用Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl小鼠模型，在该模型中，他莫昔芬能够介导对Lgr5阳性细胞中Apc基因的条件性特异性敲除，从而导致小肠和结肠中多个腺瘤的同步起始。Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl小鼠分别接受溶媒、Ar-φ或Ar-φ与伊马替尼（一种已知可通过Abl蛋白阻断EphB2信号通路的酪氨酸激酶抑制剂）的联合处理（图5k）。对结肠腺瘤的定量分析显示，Ar-φ处理组的腺瘤数量显著增加，而当伊马替尼与Ar-φ联合使用时，能够有效地阻断这种影响（图5l、m）。这些处理对这些小鼠的体重或隐血水平均没有重大影响（扩展数据图7c、d）。为了评估在Apc基因敲除前进行Ar-φ处理是否会影响Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl小鼠的肿瘤起始频率，我们在注射他莫昔芬前2周给予Ar-φ处理，并在之后继续处理2周（图5n）。在他莫昔芬处理前预先接触Ar-φ并没有进一步影响这些小鼠结肠肿瘤的起始，这进一步强化了耐辐射不动杆菌在预防肿瘤发展方面的保护作用（图5o、p）。这些小鼠长时间接触Ar-φ对其体重或隐血水平没有影响（扩展数据图7e、f）。综上所述，这些发现表明，耐辐射不动杆菌通过抑制Wnt-β-连环蛋白信号通路，进而抑制隐窝中EphB2的水平，来保护宿主免受肠道肿瘤起始的影响。

为了证实Ar-φ的作用是由于耐辐射不动杆菌数量的减少，而不是对噬菌体处理的反应，我们让小鼠接触另一种针对温和不动杆菌（A. modestus）的特异性噬菌体（Am-φ）（扩展数据图8a-c）。Am-φ处理（扩展数据图8d）对体重没有不良影响（扩展数据图8e），并且它有效地清除了小鼠结肠隐窝中的温和不动杆菌（扩展数据图8f、g）。值得注意的是，温和不动杆菌在隐窝中的定殖数量相对低于耐辐射不动杆菌。多重免疫组织化学分析显示，Am-φ处理对小鼠的EphB2表达水平、Ki-67阳性增殖细胞的数量、杯状细胞、肠内分泌细胞的数量或隐窝深度均没有影响（扩展数据图8h-m）。此外，与溶媒对照组相比，接受Am-φ处理的Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl小鼠（扩展数据图8n）在腺瘤数量上没有显著差异（扩展数据图8o、p）。这表明Ar-φ处理的效果仅仅是由于对耐辐射不动杆菌的靶向清除。

耐辐射不动杆菌介导的保护作用依赖于芳烃受体

吲哚乙酸（IAA）能够与芳烃受体（AhR）结合，已有研究表明，芳烃受体可通过影响Wnt-β-连环蛋白信号通路来保护隐窝生态位免受肿瘤发生的影响。我们假设，耐辐射不动杆菌（A. radioresistens）通过吲哚乙酸对Wnt-β-连环蛋白信号通路的调节作用可能是通过芳烃受体实现的。事实上，Ar-φ介导的对耐辐射不动杆菌的特异性清除显著降低了结肠中典型芳烃受体靶基因（如CYP1A1、CYP1B1和AHRR）的转录水平（图6a-c），而Wnt蛋白（如Wnt-2b和Wnt-9a）的相关基因表达则未受影响（扩展数据图9a、b）。因此，与对照组相比，经Ar-φ处理的小鼠近端结肠中CYP1A1的蛋白水平显著降低（图6d、e）。有趣的是，与对照组相比，在经Ar-φ处理的小鼠中，肿瘤抑制因子RNF43（一种已知的芳烃受体靶蛋白）及其对应蛋白ZNRF3（二者作为跨膜E3泛素连接酶协同作用以调节Wnt-β-连环蛋白信号通路）的表达也下调了（图6f、g）。为了确定芳烃受体（AhR）在耐辐射不动杆菌介导的对细胞增殖的影响中所起的作用，我们使用了Villin-cre-AhRfl/fl小鼠，这种小鼠的整个肠道上皮细胞中都缺乏芳烃受体（扩展数据图9c）。耐辐射不动杆菌的外膜囊泡（OMV）或外源性吲哚乙酸对Villin-cre-AhRfl/fl小鼠的类器官的细胞增殖没有影响（扩展数据图9d、e）。接下来，我们让Villin-cre-AhRfl/fl小鼠接受Ar-φ处理2周（图6h）。在这些小鼠中，靶向清除耐辐射不动杆菌对结肠中β-连环蛋白的表达（图6i、j）、EphB2的表达、细胞增殖、杯状细胞和肠内分泌细胞的数量，以及隐窝深度均没有影响（图6k-p）。为了进一步证实耐辐射不动杆菌对细胞增殖和肿瘤发生的影响是否涉及芳烃受体（AhR），我们构建了Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-AhRfl/fl小鼠模型，该模型可通过他莫昔芬介导对Lgr5阳性肠道干细胞（ISC）中的芳烃受体（AhR）进行条件性特异性敲除。与对照组相比，暴露于耐辐射不动杆菌外膜囊泡或吲哚乙酸的Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-AhRfl/fl小鼠的类器官，其细胞增殖没有变化（图6q、r），这与在Villin-cre-AhRfl/fl小鼠的类器官中观察到的情况相似。这表明，仅在肠道干细胞中敲除芳烃受体就足以阻断耐辐射不动杆菌介导的对肠道细胞增殖的影响。

图6 | 耐辐射不动杆菌通过一条依赖于芳烃受体的途径来保护结肠干细胞不发生转化

a - c. 暴露于溶媒或Ar-φ的小鼠近端结肠中CYP1A1（a）、CYP1B1（b）和AHRR（c）信使核糖核酸（mRNA）的表达情况（每组n = 6）。

d. 对暴露于溶媒或Ar-φ的小鼠近端结肠中CYP1A1蛋白表达的定量分析（溶媒组n = 8，Ar-φ组n = 9）。

e. 经Ar-φ处理后小鼠近端结肠中CYP1A1的表达情况。

f、g. 暴露于溶媒或Ar-φ的小鼠近端结肠中Rnf43（f）和Znrf3（g）信使核糖核酸（mRNA）的表达情况（每组n = 6）。

h. 对Villin-cre-AhRfl/fl小鼠连续14天灌胃给予溶媒或Ar-φ，并进行分析。

i. 蛋白质免疫印迹（Western blot）显示这些小鼠近端结肠中β-连环蛋白的表达情况。

j. 对这些小鼠近端结肠中β-连环蛋白表达的定量分析（每组n = 9）。

k. 暴露于溶媒或Ar-φ的Villin-cre-AhRfl/fl小鼠结肠卷的多光谱成像（红色为EphB2；黄色为Ki-67；青色为粘蛋白2（muc2）；白色为嗜铬粒蛋白A（chromogranin A）；绿色为E-钙粘蛋白（E-cadherin）；蓝色为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））。白色箭头所指为用相应标记物染色的细胞。

l - p. 对这些小鼠结肠中杯状细胞（l）、肠内分泌细胞（m）、EphB2（n）、Ki-67（o）和隐窝深度（p）的定量分析（每组n = 5）。

q. 对Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-AhRfl/fl小鼠的类器官进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色（绿色），这些类器官暴露于耐辐射不动杆菌（Ar）或∆trpC耐辐射不动杆菌的外膜囊泡（OMV）或吲哚乙酸（IAA）24小时。（上方：荧光通道图像。下方：荧光通道与明场通道合并的图像。）在暴露前24小时诱导Cre激活。

r. 类器官中掺入EdU的细胞情况。计数的类器官数量分别为：18个（溶媒组，Veh）、15个（耐辐射不动杆菌组，Ar）、17个（∆trpC耐辐射不动杆菌组）和17个（1毫摩尔吲哚乙酸组，1 mM IAA）。

s. 给Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl-AhRfl/fl小鼠单剂量的他莫昔芬以激活Cre，随后连续2周每天灌胃给予溶媒或Ar-φ，之后进行肿瘤评估。

t. 两组小鼠中经β-连环蛋白染色的微小腺瘤。黑色箭头所指为微小腺瘤。

u. 对两组小鼠中微小腺瘤的定量分析（每组n = 8）。

数据以平均值±标准误（mean±s.e.m.）表示。P值使用单侧学生t检验或方差分析结合Tukey多重比较检验进行计算，若P

为了验证芳烃受体在耐辐射不动杆菌（A. radioresistens）与肠道干细胞（ISC）的相互作用中所起的保护宿主免受肿瘤发生影响的作用，我们构建了Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl-AhRfl/fl小鼠，在这种小鼠中，Apc基因和Ahr基因可以在Lgr5阳性肠道干细胞中被特异性敲除。让Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl-AhRfl/fl小鼠接受Ar-φ处理2周（图6s），对其体重或隐血水平没有不良影响（扩展数据图9f、g）。接受Ar-φ处理的Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl-AhRfl/fl小鼠的腺瘤数量与接受溶媒处理的对照组相当（图6t、u），这表明在肠道干细胞中不存在芳烃受体（AhR）的情况下，特异性清除耐辐射不动杆菌对肿瘤发生没有影响。值得注意的是，接受溶媒处理的Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl-AhRfl/fl小鼠在他莫昔芬处理2周后的腺瘤数量，比Lgr5-EGFP-IRES-creERT2-APCfl/fl小鼠的腺瘤数量要多（扩展数据图9h），这表明肠道干细胞中芳烃受体（AhR）的缺失会促进腺瘤的起始。

作者简介

中国科学院上海免疫与感染研究所Shuning Zhang和Lihua Peng为本文的第一作者，中国科学院教授Parag Kundu为本文通讯作者。

Parag Kundu（通讯作者）

Parag Kundu教授是位于中国科学院上海免疫与感染研究所微生物、发育与健康研究中心（CMDH）“微生物与宿主相互作用”研究组的负责人。他曾在瑞典Karolinska学院接受博士后培训，在2019年加入微生物、发育与健康研究中心之前，他在新加坡南洋理工大学担任资深科学家。Parag教授在肠道微生物群领域拥有多年的研究经验，是悉生生物学和人类微生物群移植方面的专家。他在干细胞和癌症生物学方面也有着丰富的经验，尤其擅长转基因动物模型、离体类器官培养平台、肠道微生物调控以及基于干细胞的癌症治疗方法。Parag教授在宿主与微生物相互作用领域牵头开展研究工作，他目前的研究重点是理解在宿主处于稳态或菌群失调状态下，肠道微生物群在宿主不同年龄阶段影响宿主干细胞信号传导和功能的分子机制。目前他正带领一个多学科研究项目，旨在提供基于微生物群的干预策略，以对抗与衰老相关的疾病。

翻译：曾美尹，中国农科院基因组所硕士在读

审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后

终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导

排版：杨海飞，青岛农业大学，基因组所联培硕士在读

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来源：微生物组