摘要：器官芯片具有高时空精度和对不同宿主细胞的适应性，因此在药物发现、发育生物学研究和疾病建模方面大有可为。我们描述了一种在生物制造平台上培养毫米级功能血管化组织的详细替代方法，这种方法被称为 "评估动态事件的集成血管"，可以方便地结合类器官技术。利用合成高分子弹性
文章介绍
题目：A well plate–based multiplexed platform for incorporation of organoids into an organ-on-a-chip system with a perfusable vasculature
杂志：Nature Protocols
影响因子：IF:14.8
发表时间：2021年3月31日
#1
摘要
Abstract
器官芯片具有高时空精度和对不同宿主细胞的适应性，因此在药物发现、发育生物学研究和疾病建模方面大有可为。我们描述了一种在生物制造平台上培养毫米级功能血管化组织的详细替代方法，这种方法被称为 "评估动态事件的集成血管"，可以方便地结合类器官技术。利用合成高分子弹性体的三维冲压技术，生成了一种被称为"血管管道"的支架，其中央微通道具有机械稳定性，可支持可灌注的血管系统和各种实质组织的自组装。我们将介绍如何应用该方案，通过加入患者来源的类器官来创建血管化的心脏和肝组织、转移性乳腺癌组织和个性化胰腺癌组织。
#2
实验设计
Experimental Design
1. InVADE平台的设计、准备和组装
InVADE平台是一种基于96孔板的多重组织器官芯片，可以将人体器官的微型模型与血管系统结合起来。该平台的设计和制备过程包括以下步骤：
（1）合成一种新型的紫外线交联弹性体，用于模制AngioTube生物支架。
（2）制作AngioTube特征的主模具和96孔基板设计的微细加工。
（3）通过传统的软光刻技术制作AngioTube支架和96孔基板。
（4）组装完整的InVADE平台。
该平台的主要特点是使用细胞培养友好的聚苯乙烯材料制造，解决了PDMS微器件中吸附的问题。使用合成的弹性材料构建生物支架，为内皮细胞提供机械稳定性，并在可灌注的腔内种植内皮细胞，形成血管微环境。周围的实质空间允许在水凝胶基质中种植器官特异性细胞，并允许适当的细胞重塑成致密的3D组织。此外，该平台允许将多个器官间隔连接在一起，以评估它们之间的相互作用。
2. 细胞来源
InVADE平台和血管管生物支架的设计目的是通过使用适当的组织特异性细胞来模拟任何内皮化的组织。此外，由于血管和组织空间之间的个体区域化，InVADE平台可以用于将患者特异性干细胞直接分化为具有特异性配方培养基的高保真类器官模型。然而，为了加强InVADE平台在体内环境中的实际应用，选择内皮细胞来模拟血管化器官也很重要。在该方案中，我们使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）对血管管生物支架的管腔进行血管化。在模拟肝器官系统时，应考虑使用器官特异性的内皮细胞（如肝窦微血管内皮细胞来模拟肝器官的有孔壁）。
3. 实质细胞播种
实质细胞在组织室中的播种和重塑过程是在InVADE平台上形成功能性内皮化组织的关键。InVADE平台的基板设计包含了沟槽，形成有图案的壁，以在播种过程中容纳凝胶包裹的实质细胞。
4. 其他因素
除了设计、准备和组装，InVADE平台的成功应用还涉及其他因素。例如，该平台的应用需要使用合适的癌细胞和组织模型，以便研究癌细胞如何通过分泌外泌体或细胞外囊泡来影响远处的器官，并将其重塑为其转移宿主。该平台还需要使用标准的qPCR协议来检测细胞和组织的变化。此外，该平台的开放式设计使得可以跟踪外泌体或细胞外囊泡的扩散到远处的器官，而不会受到大型培养基储备的稀释影响。最后，该平台的应用还需要使用人类诱导多能干细胞等更人类相关的细胞来源，以便更准确地模拟人体生理学。
5. 材料
生物材料
注意：在你的研究中使用的细胞系应该定期检查，以确保它们没有支原体。
6. 试剂
聚合物合成
微细加工
InVADE板组件
●聚氨酯胶(两部分胶粘剂铸造系统；GS聚合物，货号：1552-2T50)
细胞培养
8. 抗体
9. 设备
聚合物合成
微细加工
InVADE板组件
功能组织评估
10. 试剂设置
内皮培养基
内皮细胞生长培养基-2试剂盒(EGM-2；货号CC-22011)。混合制造商提供的补充剂，并在4°C储存≤1个月。
肝组织培养基
将DMEM与FBS (10%，vol/vol)， GlutaMAX (1%，vol/vol)， 100单位/ml青霉素和100 µg/ml链霉素混合。将培养基保存在4°C，3个月后处理。
乳腺癌组织培养基
将DMEM与FBS (10%，vol/vol)，MEM非必需氨基酸溶液(1%，vol/vol)， GlutaMAX (1%，vol/vol)，100单位/ml青霉素和100 µg/ml链霉素混合。将培养基保存在4°C，3个月后处理。
心脏组织培养基
StemPro-34与补充血清、GlutaMAX (1%，vol/vol)、10 mM HEPES、64 mg/ml抗坏血酸、150 mg/ml转铁蛋白、100单位/ml青霉素和100 µg/ml链霉素混合。用0.2 Stericup真空过滤系统过滤培养基。将培养基保存在4°C，3个月后处理。
胰腺腺癌类器官培养基
混合Advanced DMEM/F12 (45%，vol/vol)， GlutaMAX (1%，vol/vol)， HEPES (1%，vol/vol)，抗生素-抗真菌药(1%，vol/vol)， B-27补充剂(2%，vol/vol)， 1.25 mM n-乙酰-l-半胱氨酸，10 nM胃泌素I， 50 ng/ml EFG, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml FGF-10，0.5 µM A83-01, 10 µM Y-27632，10 mM烟酰胺，Wnt-3a条件培养基（20%，vol/vol）和人R-Spondin1条件培养基（30%，vol/vol）。培养基保存在4°C，每10 d更换一次。
11. 预期结果
该方案提供了一个详细的概述，使工程师设计可灌注的3d血管化组织，以高含量的方式研究药物反应或揭示生理现象。该方案可以方便地将类器官整合到器官芯片平台中。我们强调了血管管生物支架在培养≥10 d时支持血管腔和3D实质组织的机械稳定性。血管管生物支架是使用一种新的3D冲压技术开发的，促进了可灌注管的开发，通过光刻技术实现了微特征。我们可以看到内皮细胞之间产生了初步的微血管连接，这些内皮细胞通过侧壁上的图案微孔将血管支架的管腔与植入在实质空间的内皮细胞（图7a，白色箭头）汇合在一起。
此外，当内皮细胞与肝细胞在组织室中共培养时，我们能够更明显地观察到管腔中的内皮细胞开始向实质空间发芽。这一重要特征可允许利用实质空间中新的动态微血管来研究药物影响，支架的用途扩展到不同的器官微环境，如凝胶包膜心肌细胞（图7b）和肝细胞（图7c）的培养，它们在血管管生物支架的支持下重塑形成功能组织。
心脏组织通过包裹悬臂支架特征进行重塑，并在第2天至第3天开始自发收缩。接种后第7天，通过免疫荧光染色，观察到心肌组织的hall标记条纹，并对肌动蛋白进行染色（图7b，绿色）。通过血管管生物支架上悬臂的位移，可以很容易地跟踪心脏组织的评估。当模型药物从入口孔灌注到心脏组织空间时，根据所关注的功能评估，可能需要通过电刺激来控制心脏组织的跳动频率和收缩力。当灌注增加心跳频率的药物时，如肾上腺素或咖啡因，看到自发跳动的心脏组织的预期收缩率增加是可以接受的。然而，当评估钙阻滞剂收缩力的变化时，在药物灌注前必须以1hz的频率刺激心脏组织。
通过将已知的转移性癌细胞系（如乳腺癌组织）连接到单个内皮化支架下的心脏组织，我们能够演示癌细胞如何浸润到腔内支架中，沿着内皮向下迁移并渗透到收缩的心肌中。更重要的是，我们看到GFP+癌细胞通过有图案的微孔向心脏组织腔室外渗。在研究的第10天，我们看到GFP+癌细胞已经完全从原来的组织腔室中迁移出来，浸润到入口和连接癌组织与心脏组织的管道中，并在心脏组织中作为肿瘤块增殖。利用平台的开孔设计，我们可以跟踪外泌体或细胞外囊泡扩散到远处的器官，而不会出现大型培养基储存库的显著稀释问题。
图7 InVADE平台上的工程功能血管化3D组织。a、血管网络模型。b、心脏组织模型。c、肝组织模型。d、肿瘤组织模型。
12. 时间安排
当第一次执行该方案时，从聚合物合成和平台制造到最终使用血管管生物支架需要16-18天的时间。聚合物合成需要2天（步骤1-16），制造主模具和平台组装需要4天（步骤17-84）。但如果涉及实验室的多名人员，这些步骤可以并行进行。此外，预聚物只需制作一次，使用寿命长达6个月，从而节省了2天的工作。同样，如果有主模具，制造过程将缩短2个小时。母模可重复使用≥50次，用于模板成型。
例如，当用户需要准备InVADE平台时，不需要每次都执行聚合物合成步骤。1,2,4预聚物可在4℃下保存至少6个月。本文推荐的1,2,4预聚物-pegdm-uv引发剂混合物可用于3D打印200个AngioTube支架，并在4°C下稳定1个月。我们建议制备5 g的预聚物混合物；然而，在单批聚合物合成中也可以制备更高体积的预聚物。使用PDMS模板成型后，AngioTube支架和invasion基板的微制造SU-8模具可以持续重复使用，而不会损坏其特征。这两种工艺都是一次性制造工艺。我们建议制备血管管生物支架的PDMS阴性模板是一个2d的过程。这是因为我们在室温下固化了PDMS负片模板。PDMS的固化也可以在100°C的更高温度下进行2小时。详细的时间信息如下所示：
在下周的推文中，我们将详细介绍该实验的具体步骤，敬请关注！
参考信息
A well plate–based multiplexed platform for incorporation of organoids into an organ-on-a-chip system with a perfusable vasculature.Nat Protoc. 2021 Apr;16(4):2158-2189. doi: 10.1038/s41596-020-00490-1.PMID: 33790475.
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