摘要：传统的生物支架材料使肿瘤类器官的分离复杂化，阻碍了类器官-免疫细胞共培养的常规应用。中南大学湘雅医院的陈翔、陈泽宇团队和西安电子科技大学李照希、费春龙团队展示了一种声学虚拟3D支架（AV-Scaf）方法来实现3D肿瘤类器官培养，从而实现肿瘤类器官-免疫细胞直接
传统的生物支架材料使肿瘤类器官的分离复杂化，阻碍了类器官-免疫细胞共培养的常规应用。中南大学湘雅医院的陈翔、陈泽宇团队和西安电子科技大学李照希、费春龙团队展示了一种声学虚拟3D支架（AV-Scaf）方法来实现3D肿瘤类器官培养，从而实现肿瘤类器官-免疫细胞直接相互作用的共培养系统，促进了癌症研究和免疫治疗的发展。
文章介绍
题目：Acoustic virtual 3D scaffold for direct-interacting tumor organoid-immune cell coculture systems（用于肿瘤类器官-免疫细胞直接相互作用共培养系统的声学虚拟3D支架）
杂志：Science Advances
影响因子：11.7
发表时间：2024年11月
#1
研究背景
Background
肿瘤类器官是自组织的3D培养物，因其保留了原始组织的形态、遗传和功能特征，可以作为强大的临床前模型。类器官和其他细胞成分（如免疫细胞）的共培养系统能更准确地复制肿瘤微环境，促进了化疗、靶向治疗和免疫治疗的临床前测试，为药物筛选和定制个性化治疗提供了一个强大的平台。共培养系统中T细胞的激活在模拟和研究肿瘤微环境中的免疫反应中起着关键作用。然而，传统的类器官培养方法，限制了肿瘤细胞与共培养细胞的直接相互作用，阻碍了共培养系统的T细胞激活效率。
细胞对机械刺激的反应是决定细胞命运的关键因素。超声（US）是一种可以对细胞施加力的机械波，并已成为类器官技术中有前途的工具，提供了一种无接触的方法来操纵和刺激细胞。US诱导的生理过程使其成为3D生物支架物理输出的一个有吸引力的替代品。
本研究开发了一种声学虚拟3D支架（AV-Scaf）方法来实现3D肿瘤类器官培养，实现了肿瘤类器官与免疫细胞直接相互作用的共培养系统，为药物开发和精确个性化治疗提供更有效的肿瘤免疫微环境。
#2
研究思路
Methods
AV-Scaf是由一个20MHz的US换能器和一个透镜产生的涡流声场，实现了肿瘤细胞的无接触聚集和机械刺激；其次，研究AV-Scaf的工艺参数以确保AV-Scaf不会对细胞活力产生影响；然后对AV-Scaf产生的肿瘤类器官进行RNA-seq分析，探索AV-Scaf类器官形成背后的潜在机制，并通过钙离子成像和共聚焦显微镜实验验证；最后基于AV-Scaf方法建立直接相互作用的肿瘤类器官-T细胞共培养系统，并探讨不同T细胞比例对肿瘤类器官的细胞毒性作用。
#3
关键研究结果
Results
1、用于无支架肿瘤类器官的AV-支架
研究人员应用AV-Scaf实现细胞组装和细胞刺激，促进3D类器官的形成。AV-Scaf涉及由US换能器和透镜产生聚焦声涡，旨在实现焦平面内肿瘤细胞的聚集。涡流聚焦声场将肿瘤细胞聚集在最佳位置，并将其聚集成适当大小的簇，同时还施加非接触式机械刺激。这促进了细胞间的交流，并在不降低细胞活力的情况下诱导进一步的自组织成为类器官。图1C显示了无支架类器官系统的形成过程。研究人员采用聚焦旋涡声场作为虚拟3D支架来加速肿瘤细胞的自组织，无支架肿瘤类器官具有高度可扩展性，并且更容易建立更准确地代表肿瘤微环境的共培养系统。图1D显示了研究人员制造的20MHz换能器。换能器堆叠由方形的Au溅射LiNbO3单晶和连接到同轴线的E焊料衬底层组成，并使用环氧树脂固定在黄铜外壳中。然后在换能器上沉积一层聚对二甲苯薄膜。图1E显示了换能器频率和回波特性。当声涡旋光束与物体相互作用时，角动量在涡旋光束和物体之间传递。聚焦涡旋光束可以极大地增强涡旋光束与细胞之间的相互作用，从而使细胞同时被捕获和旋转。图1F为旋涡透镜的设计参数及照片。在不同的z轴平面上显示了xy平面上的模拟振幅（上）和相位（下）。研究人员又进一步展示了数值模拟中声场的3D形状和辐射力的方向。图1I为模拟强度（左）和相位（右）在焦平面上的俯视图，表明强度在中心高度集中，其周围存在相位涡。（图1）使用这些可协调的声场开发无支架的3D培养方案。
图1用于无支架肿瘤类器官的 AV-Scaf 示意图。
2、离子通道激活诱导的细胞自组织
为了验证AV-Scaf构建无支架肿瘤类器官的能力，研究人员设计了相应的培养系统。在聚苯乙烯（PS）腔体的底部附着一层半透明的聚烯烃（PO）薄膜，实现了声音的无损传播。研究人员还研究了AV-Scaf的工艺参数以确保AV-Scaf方法不会对细胞活力产生不利影响。首先评估了用AV-Scaf处理2分钟和不同驱动电压5天后形成的类器官形态。结果发现，60mV的小电压可能没有足够的机械刺激来激活黑色素瘤和乳腺癌组离子通道；140mV组会产生过大的细胞团，并且由于细胞组装体积的增加而无法达到足够的生长。其次，估计了用AV-Scaf处理的类器官在不同时间段和电压下的细胞活力。结果发现，当暴露时间超过临界值240s时，细胞活力明显降低。此外，施加电压180mV和曝光时间180s对细胞活力也有影响。这些结果说明AV-Scaf需要有合适的工艺参数。因此，研究人员选择了100mV的施加电压，测量了在100mV电压下处理2分钟的类器官直径。乳腺癌和黑色素瘤的类器官生长图像显示，在培养平面上用AV-Scaf处理的细胞在1天后表现出明显的自组织行为。研究人员进一步比较了AV-Scaf和基于基质胶的方法获得的肿瘤类器官的形态学特征。结果发现，AV-Scaf培养的乳腺癌和黑色素瘤类器官的大小和形态与基质胶培养中形成的类器官相似。免疫荧光（IF）染色结果表明，两种技术产生的类器官都能表达与其来源相关的特定标记。这表明，无论其形态或特定标记如何，两种方法产生的类器官在其特征上表现出一致性。苏木精和伊红（H&E）和免疫组织化学（IHC）染色结果表明，AV-Scaf产生的类器官具有与患者组织相同的组织结构，并表达相同的标记。（图2）
接下来，研究人员探索了AV-Scaf类器官形成背后的潜在机制。对AV-Scaf产生的黑色素瘤类器官进行了RNA-seq分析。差异表达基因（DEG）统计数据显示，与对照组（未经AV-Scaf治疗的患者来源的肿瘤细胞）相比，其中464个基因显著上调，186个基因显著下调。图3B显示了生物重复之间的高度一致性，以及对照组和AV-Scaf组之间的显著差异。主成分分析清楚地区分了对照和受激样品。基因集富集分析（GSEA）突出了钙介导的信号、组织形态发生和上皮-间质转化途径的显著富集。基因本体（GO）富集分析显示，在细胞粘附、钙离子转运和信号转导等过程中存在显著的富集。GO富集分析阐明了主要受US刺激影响的生物过程和分子功能。图3E突出了细胞-底物粘附、细胞对氧水平的反应和细胞粘附的积极调节等过程，这些都是组织形态发生和细胞分化的关键。钙介导信号的富集进一步证实了钙离子在这些过程中作为关键的次级信使的作用。图3F关注的是上调基因，强调了与组织发育、细胞分化调控和钙离子运输相关的富集术语。信号转导通路的丰富，特别是那些涉及钙离子的信号转导通路，与假设的US刺激的机械转导作用一致，促进钙流入和随后的下游信号级联。对钙和粘附相关基因的热图分析显示出不同的表达模式，表明对US刺激有不同的调控反应。AV-Scaf方法虽然只涉及短暂的US刺激，但显示出RNA-seq结果促进细胞内钙内流并增强细胞粘附行为。这显著加快了肿瘤簇内细胞间的相互作用，从而促进了肿瘤细胞的自组织过程。（图3）
AV-Scaf的潜在机制示意图表明AV-Scaf显著激活离子通道，增强钙离子流动，可能促进细胞的自组织过程。维恩图表明，尽管大量基因是钙离子通道或细胞粘附所特有的，但也存在大量重叠。在图4C中，火山图通过显示类器官和对照之间基因表达的显著变化，强调了相互关联性。因此，研究人员进行了钙离子成像和共聚焦观察由AV-Scaf形成的两个肿瘤类器官的细胞外基质（ECM）生成来验证RNA-seq结果。Fluo-4染色荧光显微镜图像显示，在1小时观察到最高的荧光，表明细胞内钙水平在US刺激后立即出现短暂的峰值，这表明US可能通过机械敏感通道诱导钙离子快速流入。钙离子成像结果与基因测序数据一致，表明参与钙信号通路的基因上调。使用Fluo-4 AM进行流式细胞术分析，与对照组相比，刺激后1小时钙离子荧光强度显著增加，随后在24小时下降；并在图4H中被量化。乳腺癌和黑色素瘤类器官的共聚焦显微镜图像结果显示通过US捕获的细胞簇不含ECM；相反，自组织的肿瘤类器官在肿瘤细胞之间产生ECM。在这两种类器官类型中，有明显的大量ECM沉积，以强烈的纤维连接蛋白（红色）和层粘连蛋白（绿色）信号为标志，它们合并在合成图像中产生黄色覆盖层。共聚焦显微镜的结果进一步验证了基因测序的发现。在乳腺癌和黑色素瘤类器官中观察到的大量ECM在US刺激下产生，证实了钙介导的途径参与调节肿瘤微环境。纤维连接蛋白和层粘连蛋白（ECM的关键成分）的增强沉积突出了ECM的重塑，可能影响肿瘤的进展和转移。通过钙通道阻断（CCB）实验进一步证明钙离子内流对使用AV-Scaf方法形成肿瘤类器官的显著影响。Elisa结果表明，钙通道的阻断显著降低了细胞粘附相关蛋白的含量。这表明钙离子内流与细胞粘附之间存在密切联系，阻断钙离子进入影响细胞的自组织能力。通过调节钙内流和细胞粘附，AV-Scaf可以作为一种潜在的培养策略来改变生物支架，从而促进细胞的自我组织和生长。（图4）
图2乳腺癌和黑色素瘤类器官通过开发的AV-Scaf。
图3 AV-Scaf辅助肿瘤类器官和肿瘤细胞的转录组学比较
图4 使用AV-Scaf对肿瘤类器官中ECM生成的钙离子成像和共聚焦观察。
3、直接相互作用的共培养系统使T细胞活化效率更高
研究人员将黑色素瘤类器官与T细胞共培养，以证明AV-Scaf方法的优越性。最初，单个细胞悬浮液基于AV-Scaf方法，生成肿瘤细胞簇，然后将这些簇培养成无支架的肿瘤类器官。并从同一患者身上获得外周血单个核细胞（PBMCs）。然后引入T细胞创建一个直接相互作用的肿瘤类器官共培养系统。流式细胞术结果显示，与基质胶相比，使用AV-Scaf方法可以显著增强T细胞的活化。在AV-Scaf组中，CD45+CD8+GZMB+细胞的百分比明显高于基质胶组，且CD45+CD8+IFN-γ+细胞在AV-Scaf组中也比在基质胶组中明显更普遍。这些发现表明，AV-Scaf方法产生的肿瘤类器官中不含基质胶，促进了肿瘤细胞与T细胞的直接接触，从而增强了T细胞的活化。
研究人员建立了两种T细胞与肿瘤细胞比例的共培养模型，探究不同T细胞比例对肿瘤类器官的细胞毒性作用。活/死染色结果显示，与T细胞共培养最初，可以看到大量的活细胞；然而，随着时间延长至48h，死细胞数量显著增加。类器官活力研究结果表明，随着时间的推移，生存能力下降，在T细胞比例较高时更为明显。图5I描述了从被T细胞包围的类器官到被破坏的结构的转变，表明有效的T细胞活性。细胞毒性试验显示，T细胞比例增加导致细胞毒性增加，特别是在48小时内，证实了T细胞在诱导类器官细胞死亡方面的有效性。研究还发现，T细胞比例增加，类器官体积显著降低，在T细胞比例较高时更为显著，这与观察到的细胞毒性增加有关。这些结果为在无支架类器官模型中T细胞-肿瘤相互作用的动力学提供了重要的见解。（图5）
图5由AV-Scaf促进的直接相互作用肿瘤类器官-T细胞共培养系统的建立和分析。
结论
AV-Scaf方法为生成肿瘤类器官和直接相互作用的共培养系统提供了一个强大而通用的平台。通过US刺激调节钙信号和ECM产生的能力为细胞自我组织和肿瘤微环境重塑的机制基础提供了有价值的见解。此外，AV-Scaf方法的可扩展性和简单性使其成为高通量筛选和个性化医学应用的有吸引力的选择。未来将探索AV-Scaf在更广泛的肿瘤类型和免疫细胞亚群中的应用，并将该方法与高通量筛选技术相结合，以加速发现有效的治疗药物。通过为类器官培养提供更可靠和可扩展的平台，AV-Scaf方法有可能对组织工程和再生医学领域产生重大影响，最终有助于改善癌症患者的临床结果。
参考文献
Shan H, Chen M, Zhao S, Wei X, Zheng M, Li Y, Lin Q, Jiang Z, Chen Z, Fei C, Li Z, Chen Z, Chen X. Acoustic virtual 3D scaffold for direct-interacting tumor organoid-immune cell coculture systems. Sci Adv. 2024 Nov 22;10(47):eadr4831. doi: 10.1126/sciadv.adr4831. Epub 2024 Nov 22. PMID: 39576870; PMCID: PMC11584020.
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来源：培养盒守护者
