摘要：本研究通过分析来自癌症基因组图谱（TCGA）和中国前列腺癌基因组和表观基因组图谱（CPGEA）的RNA测序数据，描绘了中西方人群前列腺癌相关嵌合RNA图谱，并分析了中西方人群嵌合RNA的异同，

中国人群前列腺癌嵌合RNA图谱与西方人群的异同

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研究论文

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本研究通过分析来自癌症基因组图谱（TCGA）和中国前列腺癌基因组和表观基因组图谱（CPGEA）的RNA测序数据，描绘了中西方人群前列腺癌相关嵌合RNA图谱，并分析了中西方人群嵌合RNA的异同，

建立了首个中国人群前列腺癌的嵌合RNA空间表达谱，为探索前列腺癌发生发展的机制提供了宝贵资源。

● 第一作者：王琼、于顺利、揭济榕

● 通讯作者：黄海（huangh9@mail.sysu.edu.cn）、李辉（hl9r@virginia.edu）、高旭（gaoxu.changhai@foxmail.com）

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亮 点

● 对中国人群前列腺癌的嵌合RNA进行了系统性分析；

● 描绘了前列腺癌及其微环境中间质细胞嵌合RNA的空间表达谱；

● 开展了嵌合RNA的功能学研究并分析了其对肿瘤微环境的影响。

摘 要

由染色体重排产生的嵌合RNA长期以来已被证实是多种癌症的标志物和治疗靶点。近年来，基因间的反式剪接和顺式剪接（Cis-SAGe）也被证明能够生成嵌合RNA。它们通过编码融合蛋白、作为长链非编码RNA或环状RNA发挥作用，或通过改变亲本基因的表达来影响肿瘤进展。本研究中，我们分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）和中国前列腺癌基因组与表观基因组图谱（CPGEA）的嵌合RNA，揭示了西方和中国人群前列腺癌（PCa）之间嵌合RNA表达谱的异同。我们阐明了肿瘤上皮细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和T细胞之间独特的嵌合RNA表达模式，并证实了嵌合RNA可以影响肿瘤细胞生长、调控间质细胞极化并影响微环境中的细胞间通讯。这项综合性研究建立了中国人群前列腺癌嵌合RNA表达图谱，强调了人群特异性差异，并展示了具有诊断、预后和治疗潜力的嵌合RNA。

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全文解读

引 言

前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤，表现出明显的种族差异。前列腺癌发病率在不同人群中差异很大，北欧发病率最高，而中亚南部最低，但亚洲人口的病死率（MR/IR）最高。来自大型西方临床数据集的基因组和转录组已有较为全面的研究，但西方人群的PCa特征并不完全适用于中国人群。

多年来，嵌合RNA已被证实为癌症诊断和治疗靶点，并可通过多种机制影响肿瘤进展。嵌合RNA在多种癌症中的作用已经被证实，但它们主要依赖于永生化的肿瘤细胞系，这不可避免地忽略了肿瘤微环境（TME）中的其他关键细胞。此外，目前仍缺乏PCa相关嵌合RNA的综合图谱，尤其是在中国人群中。

在本研究中，我们筛选、鉴定并分析了癌症基因组图谱（TCGA）和中国前列腺癌基因组和表观基因组图谱（CPGEA）的嵌合RNA，对比了两个队列之间的相似性和差异性。我们验证了许多在肿瘤和邻近正常组织之间差异表达的嵌合RNA。更加重要的是，这些嵌合体以不同的表达频率分布在肿瘤及其周围的间质细胞中，其中包括癌相关成纤维细胞（CAFs），肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和T细胞。嵌合RNA的种族差异突出了在不同PCa人群中进行进一步探索的必要性。大量已验证的具有功能的嵌合RNA为中国人群提供了一系列潜在的生物标志物或治疗靶点。

结 果

嵌合RNA的发掘过程及特征

经Ericscript软件分析后，我们在TCGA中共预测了25,944个嵌合RNA，而在CPGEA中预测了101,973个嵌合RNA（图1A和表S1,2）。根据连接位点的不同，它们可分为E/E、E/M、M/E和M/M四种类型。由于M/M的验证率较低，我们去除掉此类型的转录本后在CPGEA中剩下30,315个而在TCGA剩下11,749个嵌合RNA。两个数据库中嵌合RNA总数的差异可能是测序深度的不同造成的。我们进一步根据染色体的位置将嵌合RNA分为通读、染色体间和染色体内共三种类型。其中染色体间嵌合RNA是最常见的类型，提示该类嵌合RNA是染色体重排或反式剪接的产物，表明这两种机制可能是导致嵌合RNA产生的主要原因（图1B）。

不同于染色体间和染色体内嵌合RNA（图S1A，B），我们发现更多的通读嵌合RNA提示更差的预后（图1C）。值得注意的是，在TCGA中，癌组织中的通读嵌合RNA明显高于相邻的非癌组织（图S1C），但在CPGEA中却没有差异（图S1D）。在CPGEA中，高Gleason评分肿瘤比低评分肿瘤显示更多的通读嵌合RNA，而TCGA中却没有这种差异（图1D）。上述结果表明通读嵌合RNA可能在西方人群中与肿瘤发生有关，但在中国人群中与肿瘤进展相关。

我们重点研究了高频出现的嵌合RNA（在 ≥ 5例患者中检测到）。经过UCSC的BLAT验证后，TCGA中鉴定出384个而CPGEA中共鉴定出1,351个嵌合RNA（图S1E）。我们列出了表达频率最高的十个嵌合体（图1E）。一些常见的嵌合RNA在两个人种之间存在明显差异，这表明某些嵌合RNA可能与PCa差异有关，并且可以指导种族特异性的诊断或治疗。

对母基因的GO富集分析表明，TCGA和CPGEA中的5′基因富集在在蛋白质加工、降解和转运等过程。对于3′基因，TCGA显示出富集在葡萄糖代谢过程，而CPGEA显示出富集在大分子生物合成，氮化合物生物合成和阳离子结合等过程（图1F，G）。这些结果表明5′基因可能参与了两个人群相似的通路，但3′基因可能参与了前列腺癌的进展，这可能与中国人群的高MR/IR有关。

图1. 嵌合RNA的发现、鉴定和分类

（A）嵌合RNA的发现、验证、功能分析和临床应用的示意图。（B）根据融合类型对中国前列腺癌基因组和表观基因组图谱（CPGEA）中的30,315个以及癌症基因组图谱（TCGA）中的11,749个非M/M嵌合RNA进行分类。（C）基于CPGEA和TCGA数据库中通读嵌合RNA的数量进行无生化复发生存率分析（87.5%低表达对比12.5%高表达）。（D）在Gleason评分为6的CPGEA患者中，通读嵌合RNA的数量明显较低，在TCGA中不同Gleason评分肿瘤样本之间没有差异。（E）CPGEA和TCGA十个表达频率最高的嵌合RNA。（F-G）CPGEA和TCGA嵌合RNA中5′和3′亲本基因的GO分析。（H）AGREP流程图，说明计算机模拟长读验证方法。（I-J）一个代表性的I型嵌合MBD1-CFAP53与不良预后相关，基于MBD1-CFAP53读数的GSEA差异基因分析显示P53通路富集。（K-L）RAB3B-NRD1是一种与预后相关的具有代表性的II型嵌合RNA。基于RAB3B-NRD1读数的GSEA差异基因分析显示DNA损伤相关通路富集。（M-N）DUS4L-BCAP29是一种与预后无关的具有代表性的III型嵌合RNA，基于DUS4L-BCAP29读数的GSEA差异基因分析显示雄激素应答相关通路富集。****p

中国人群嵌合RNA的验证

关于中国人群嵌合RNA的研究有限且考虑到中国人群PCa更差的预后，我们因此重点关注了中国人群PCa相关的嵌合RNA。1,351个嵌合RNA中大约一半3′基因连接位点位于其3′UTR，但是没有一个能够被RT-qPCR验证，表明这种类型的嵌合RNA具有很高的假阳性率（数据未展示）。我们因此关注余下的635个嵌合RNA（图S1F），其中301个在AGREP分析后显示癌和癌旁的差异表达（表S3）。我们进一步通过计算机模拟长读对这些嵌合RNA进行验证，其中84个嵌合具有较高的长读置信度（图1H和表S4，5）。

我们设计了结合连接位点两侧亲本基因的特异性嵌合RNA引物（表S6）。通过对34对临床PCa样本混合cDNA进行RT-qPCR，Sanger测序证实了其中101个确实存在，而其中大部分是新型嵌合RNA（图S1F，2，3）。我们注意到实验验证和生信预测的嵌合RNA之间有明显的重叠（图S4A），提示我们新开发的嵌合RNA预测技术具有较高的精度。

我们将101个嵌合RNA分为三型。I型，肿瘤组织中高表达与较差预后相关。例如MBD1-CFAP53在PCa中表达升高（图S4B）并且与较差的预后相关（图1I）。MBD1-CFAP53的差异基因分析显示P53通路的富集（图1J，S4C），而P53又是PCa进展的关键调控因子。II型，肿瘤组织中高表达与较好预后相关，提示该类嵌合RNA与治疗敏感性可能相关，类似于我们以前报道的NEIL3基因。例如RAB3B-NRD1在肿瘤中高表达（图S4D）但与更好的预后相关（图1K）。差异基因分析发现了DNA损伤相关途径的富集（图1L，S4E），说明RAB3B-NRD1可能与NEIL3具有相似的功能。因此，I型和II型嵌合RNA可能是新的PCa预后生物标志物和/或治疗靶点。III型，嵌合RNA的表达水平与预后无关。由于几乎所有的PCa患者最初都会接受雄激素剥夺治疗（ADT），如果这些嵌合RNA与雄激素受体（AR）相关，ADT治疗可能会掩盖其对PCa进展的影响。例如DUS4L-BCAP29在肿瘤中过表达（图S4F）但与预后无关，差异基因分析显示AR应答途径富集（图1M，N，S4G）。

嵌合RNA在肿瘤细胞和肿瘤微环境中细胞的表达情况

由于CPGEA的RNA-seq数据来源于临床样本而并非细胞系，因此一些嵌合RNA可能存在于构成TME的间质细胞中。我们使用荧光激活细胞分选（FACS）技术从中国PCa临床样品中分离出癌细胞、CAFs、TAMs和T细胞（图2A）。在验证了分选的有效性后（图S4H），我们从这些细胞中提取了RNA进行进一步验证。在101个嵌合RNA中，65个在癌细胞中得到证实，45个在CAFs中证实，44个在TAMs中证实，27个在T细胞中证实（图2B，S5-S8）。

我们进一步使用现有的永生化细胞系检测嵌合RNA。由于无现成的永生化CAFs细胞，我们从中国PCa患者中提取了CAFs，通过western blot验证后（图S9）进一步永生化了该CAFs。在上述101个嵌合RNA中，81个在癌细胞中得到验证，46个被证实存在于CAFs，53个被证实存在于TAMs，而59个被证实存在于T细胞（图S10-S13）。永生化细胞系的嵌合RNA表达谱与临床组织来源的细胞明显不同（图2C）。我们认为是肿瘤的异质性是造成这种差异的主要原因。值得注意的是，除CAFs外，其他永生化细胞系均来源于西方人群，一旦获得中国人群来源的其他永生化细胞系，本研究中的一些观察结果可能需要重新验证。

图2. 肿瘤和间质细胞中嵌合RNA的分布及其功能

（A）FACS技术从临床样品中分离癌细胞、癌相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和T细胞示意图。（B）临床组织来源的癌细胞、CAFs、TAMs和T细胞之间嵌合RNA重叠的维恩图。（C）比较临床组织来源癌细胞和PCa细胞系、临床组织来源的CAFs和永生化CAFs细胞系、临床组织来源的TAMs和TAMs相关细胞系以及临床组织来源的T细胞和T细胞系之间的重叠嵌合RNA。（D）基于是否可在核糖体中检测到、细胞核和细胞质的分布、是否对RNase R抵抗对嵌合RNA进行分类。（E）SLC45A3和ELK4之间通读发生的示意图。方块表示外显子、线条表示内含子或基因间区域、红色箭头表示连接位点。引物根据亲本基因的外显子或内含子区域设计。（F）使用两对不同的引物扩增SLC45A3-ELK4（e4e2）的TD-PCR的凝胶电泳图。（G）来自肿瘤细胞系的RNA用脱氧核糖核酸酶I处理，并分成两组：有或没有使用AMV进行逆转录，验证了SLC45A3的4号外显子和4号内含子之间的连接序列。（I）在SLC45A3-ELK4（e4e2）敲低后评估PC3和DU145细胞活力的平板克隆实验。（J）敲低SLC45A3-ELK4（e4e2）后PC3和DU145的迁移实验代表性图像和统计分析直方图。（K）PC3细胞与TAMs或CAFs共培养示意图。左图：与MPC2-ADCY10敲低后的PC3细胞共培养的M0型TAMs中M1和M2型TAMs相关标志物表达水平的RT-qPCR分析。右图：与SMG5-PAQR6敲低后的PC3细胞共培养的CAFs的CAFs相关标志物变化的蛋白质印迹分析。（L）ERV3/1-ZNF626与预后不良相关。（M-N）与NFs或CAFs共培养的PC3细胞平板克隆和transwell实验的代表性图像和统计分析直方图。（O-P）与ERV3/1-ZNF626敲低后的CAFs共培养的PC3平板克隆和transwell实验代表性图像和统计分析直方图。（Q）嵌合RNA作用机制示意图。****p pp

嵌合RNA的功能特征

为评估嵌合RNA的蛋白编码潜能，我们从PCa细胞系中提取了核糖体相关RNA。发现59个嵌合RNA可与核糖体结合，表明大多数已鉴定的嵌合RNA可能可以编码蛋白（图2D，S14）。嵌合RNA在细胞内的不同定位常提示它们不同的作用机制。核质分离显示28.4%的嵌合RNA主要定位于细胞质，9.9%的嵌合RNA主要定位于细胞核，余下61.7%的嵌合RNA可同时定位于细胞质和细胞核（图2D，S15）。另外，环状RNA（circRNA）已被报道影响肿瘤进展，但嵌合RNA是否也存在环状的形式仍罕有报道。我们进一步的RNase R抵抗实验证实101个嵌合RNA中的8个可能是circRNA（图2D，S16）。

嵌合RNA可以直接影响PCa的发生发展

我们选取了永生化肿瘤细胞和FACS分选的临床样本肿瘤细胞中共有的58个嵌合RNA并设计了特异性的siRNA进行敲低实验，发现其中8个嵌合RNA可被敲低50%以上（图S17）。其中一个新的嵌合SLC45A3-ELK4（e4e2）引起了我们的兴趣，其另一种亚型e1e2曾被报道可促进PCa进展。我们设计了结合SLC45A3第1个外显子的正向引物以及结合ELK4最后一个外显子的反向引物，通过RT-PCR和Sanger测序证实SLC45A3-ELK4（e4e2）包含SLC45A3的前4个外显子和ELK4的后4个外显子（图2E，F）。我们随后设计了可结合ELK4第5个外显子的反向引物，并使用DNase I处理后的RNA（R2）进行逆转录以获得包含ELK4序列的所有转录本，接着使用结合于SLC45A3第4个外显子和第4个内含子的引物进行PCR扩增，Sanger测序结果证实SLC45A3-ELK4（e4e2）是相邻基因之间经顺式剪接方式形成的产物（图2G，H）。更加重要的是，敲低SLC45A3-ELK4（e4e2）显著降低了肿瘤细胞的增殖和迁移能力（图2I，J），表明嵌合RNA可以直接调控肿瘤的发生发展。

肿瘤细胞相关嵌合RNA可以改变肿瘤微环境中间质细胞的表型

MPC2-ADCY10在肿瘤中表达明显上调（图S18A），且在PSMA阳性的癌细胞中特异性表达，但它不直接影响PCa细胞活力（图S18B）。然而，当M0型TAMs与MPC2-ADCY10敲低的PC3细胞共培养时，M1相关标志物上调，同时M2相关标志物下调（图2K），表明MPC2-ADCY10可能影响肿瘤细胞和TAMs之间的通讯。

CAFs共可分为四个亚型，其中只有CD29和FAP高表达的I型和IV型促进肿瘤进展。SMG5-PAQR6存在于癌细胞且在肿瘤组织中明显表达（图S18C），但在肿瘤细胞中敲低SMG5-PAQR6并不影响其细胞活力（图S18D）。但当CAFs与SMG5-PAQR6敲低的PC3细胞共培养时，CD29和FAP的表达均显著下调（图2K），表明该嵌合RNA可以介导肿瘤细胞和CAFs之间的通讯。

间质细胞来源的嵌合RNA参与调控肿瘤微环境和肿瘤细胞的可塑性

我们将THP-1诱导为M0、M1和M2表型的TAMs后（图S19A）进行RT-qPCR检测，结果发现62.1%的TAMs相关嵌合RNA在M2中上调，20.7%在M1中上调，17.2%在M1和M2之间无显著差异（图S19B）。通过检测CD25和CD69的表达我们成功将Jurkat活化（图S20A）。RT-qPCR结果证实30.8%的T细胞相关嵌合RNA在活化的Jurkat细胞中上调，23.1%下调，其余没有显著变化（图S20B）。

我们紧接着从三对肿瘤和癌旁正常样本中提取正常成纤维细胞（NFs）和CAFs，并利用Western blot 证实CAFs高表达CAFs相关标记物（图S21A）。我们选取了在临床CAF和永生化CAF中共表达的30个嵌合RNA。即使将个体差异因素考虑在内，我们仍发现其中5个嵌合RNA在三对样本中的CAFs中明显上调，6个嵌合体表达下调（图S21B）。进一步siRNA敲低试验发现其中7个在永生化CAFs中可被敲低50%以上（图S22A，B）。其中ERV3/1-ZNF626（e1e2）引起了我们的关注：其在肿瘤样本中明显高表达且提示更差的预后（图2L，S22C）。在CAFs中敲低ERV3/1-ZNF626（e1e2）可以使CAFs相关标志物表达下调（图S22D），表明其可以维持CAFs的表型。我们进一步建立了它们与肿瘤细胞的共培养体系，与NFs相比，CAFs可显著促进PCa细胞的增殖和迁移（图2M，N），而在CAFs中敲低ERV3/1-ZNF626（e1e2）可以挽救CAFs对PCa细胞的作用（图2O，P），上述结果表明CAFs对PCa细胞的作用部分依赖于ERV3/1-ZNF626（e1e2）。

结 论

本研究中我们鉴定了大量新型嵌合RNA，它们可能补充已知的标记基因作为PCa组织中的各类细胞系的新型标记物。更加重要的是，我们证实这些嵌合RNA至少通过三种机制影响肿瘤进展（图2Q）,包括嵌合RNA直接调控肿瘤的发生发展、影响肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的通讯以及直接调控肿瘤微环境。

方 法

生物信息学

癌症基因组图谱（TCGA）的前列腺癌RNA-seq数据可直接从https://portal.gdc.Cancer.gov下载，中国前列腺癌人群的数据来源于人类基因组序列档案http://bigd.big.ac.cn/gsa-Human。我们使用EricScript软件（0.5.5b版本）默认参数并通过比对hg38基因组来预测嵌合RNA。舍去EricScore小于0.6的嵌合RNA，并使用BLAT过滤掉假阳性事件。加州大学圣克鲁斯分校的基因组浏览器（http://Genome.UCSC.edu）用于确认候选嵌合体的真实性。使用SangerBox工具（http://SangerBox.com/）进行嵌合RNA的亲本基因的KEGG富集分析。此外，使用软件Agrep（https://www.tgries.de/Agrep）计算CPGEA中嵌合RNA及其亲本基因的读数。

用于计算机模拟验证的样本于表S4列出。如前所述，Ugrep（https://github.com/genivia/Ugrep）软件选取嵌合RNA连接位点两侧各14bp序列比对至Hg38基因组，将高频出现的嵌合RNA（在 ≥ 5例患者中检测到）用BLAT进行人工比对，根据GENCODE版本44（Ensembl110）进行基因注释，相关结果于表S5列出。

临床样本

从中山大学孙逸仙纪念医院收集了32例PCa患者的新鲜肿瘤和癌旁正常组织，以验证候选嵌合RNA。使用另外20个新鲜的临床样本用于FACS以分离肿瘤细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和T细胞。每种细胞类型分别从5个样本中提取。

RNA提取，RT-qPCR，Touch-down PCR，琼脂糖电泳和Sanger测序

TRIzol试剂（15596026，Invitrogen，美国）用于细胞总RNA提取。使用VersocDNA合成试剂盒（AB1453A，ThermoFisherScientific，美国）以随机六聚体引物合成互补DNA。ABI Step One Plus实时PCR系统（4376600，Applied Biosystems，美国）进行定量实时PCR（RT-qPCR）。表S6列出了301个嵌合RNA的特异性引物。使用Platinum Taq High Fidelity Ki（11304011，Invitrogen，美国）进行Touch-down PCR（TD-PCR）。扩增SLC45A3-ELK4（e4e2）全长的PCR引物列于表S7中。T细胞和TAM相关标记基因的PCR引物列于表S8中。

2%琼脂糖凝胶用于分离100~300bp的DNA产物，1%琼脂糖凝胶用于分离更长的DNA产物。嵌合RNA连接序列示意图从瑞生科技的Sanger测序结果中截取。

细胞分选与永生化CAF细胞系的构建

从临床PCa患者中分离出新鲜组织，用预冷的PBS冲洗直到无肉眼可见的血液残留，切除超声刀烧焦区和脂肪组织。将剩余的组织切成碎片，并在37°C连续振荡下用0.1% Liberase（1020763；Roche；瑞士）消化40分钟。然后将悬浮液通过200 μm滤网过滤，得到的单细胞悬液是所有类型细胞的混合物，将上述细胞悬液分别作以下处理：1）与以下荧光抗体共培养：PE抗人CD14（325605，BioLegend，美国），Alexa Fluor 488抗人PSMA（342505，BioLegend，美国），Brilliant Violet 421™抗人CD3（317343，BioLegend，美国）和PE抗人PDGFRα（323505；BioLegend，美国），然后通过流式细胞仪分离TAMs、肿瘤细胞、T细胞和CAFs；2）构建永生化CAF细胞系。将PDGFRα阳性的CAFs接种于10 cm细胞培养板中，在37°C，5%二氧化碳的加湿环境中培养。对CAFs相关标记物α-SMA、FAP和PDGFRα进行Western blot验证后，将CAFs送往应用生物材料公司（Applied Biological Materials，ABM）进行永生化处理。

蛋白提取和蛋白质印迹分析

使用我们既往已发表文章的成熟方法进行蛋白提取和Western blot分析：使用RIPA裂解缓冲液（P0013B，Beyotime，中国）收集细胞样品中的蛋白质，并用10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并与以下一抗在4°C孵育16小时：PDGFRα（ab32570；Abcam；英国）、GAPDH（GB11002；Servicebio；中国）、FAP（A6349；Abclonal；中国）、α-SMA（A17910；Abclonal；中国）、CD29（12594-1-AP；Proteintech；美国）。

然后将膜与二抗在室温下孵育1小时。使用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（WBKLS0500，Merck Millipore，Germany）拍摄蛋白条带。

细胞培养

Jurkat，THP-1，LNCaP，C4-2，PC3，DU145和22Rv1购自ATCC（American Type Culture Collection）。使用包含10%胎牛血清（A5256701，Gibco，美国）和1%青霉素/链霉素（15140122，Gibco，美国）的RPMI 1640（Jurkat，THP-1，LNCaP，C4-2，PC3和22Rv1）或Dulbecco改良的Eagle培养基（原代NFs，原代CAFs，永生化CAFs，DU145）（11965092，Gibco，美国）对相应细胞进行培养。细胞在恒温37°C、含5%二氧化碳的培养箱中进行培养。

Jurkat细胞活化与THP-1细胞的极化

用CD3/CD28免疫磁珠以1:1的比例（11161D，Gibco，美国）刺激Jurkat细胞。24小时后通过RT-qPCR检测相应标记物以证实Jurkat细胞是否被活化。

将THP-1细胞与150 nM PMA（70-CS0001，Lianke Bio，中国）培养24小时以获取M0型TAMs。然后将M0型TAMs在含有20 ng/ml干扰素-γ（IFN-γ）（Z02915-10，GenScript，中国）和10 pg/ml脂多糖（LPS）（L861706，Macklin，中国）的无血清RPMI 1640培养基中培养24小时以诱导M1型TAMs的产生。将M0型TAMs在含有20 ng/ml白细胞介素-4（IL-4）（PRP2017，Abbkine）和20 ng/ml白细胞介素-13（IL-13）（PRP100108，Abbkine）的无血清培养基24小时获得M2巨噬细胞。RT-qPCR检测相应标志物以明确M0、M1和M2型TAMs是否被成功诱导。

siRNA转染

嵌合RNA相关的干扰RNA（siRNA）寡核苷酸购自Gene Pharma（Shanghai，中国）。siRNA序列列于表S9中。使用与3 μL/mL Lipofectamine RNAiMAX（13778150，Thermo Fisher Scientific，美国）混合75 nM siRNA进行转染，孵育48小时后用于RNA提取和细胞功能实验。

平板克隆实验和细胞迁移实验

进行平板克隆实验以检测细胞活力，将PCa细胞（每孔1000个DU145细胞或1500个PC3细胞）接种到6孔板中，培养10天后计算细胞克隆数。

使用8 μm孔径聚对苯二甲酸乙二酯 (PET) 膜的细胞培养嵌入皿（353097，Corning，美国）进行迁移实验，下室使用含10% FBS的DMEM或RPMI 1640培养基，上室接种40,000个细胞并添加200 μL无血清DMEM或RPMI 1640培养基。DU145细胞孵育10小时、PC3细胞孵育24小时后细胞可通过PET膜迁移到下室。膜用结晶紫染色，并使用Olympus IX71倒置显微镜（Olympus，Japan）拍摄迁移到下室的细胞。

统计分析

本研究所有定量数据均使用GraphPad（La Jolla, CA, 美国）进行统计学分析，单因素方差分析后Tukey's post-hoc检验用于多重比较，结果用平均数±标准差表示。使用配对t检验分析TCGA和CPGEA中的配对样本。Kaplan-Meier法用于描述无生化复发生存曲线，并在Log-rank检验后将p ＜ 0.05视为具有统计学意义。P值在图中标记如下：*pppp

代码和数据可用性

引文格式：

Qiong Wang, Shunli Yu, Jirong Jie, Justin Elfman, Zhi Xiong, Sandeep Singh, Samir Lalani, Yiwei Wang, Kaiwen Li, Bisheng Cheng, Ze Gao, Xu Gao, Hui Li, Hai Huang. 2025. "Profiling chimeric RNA in prostate cancer in Chinese cohorts reveals similarities and differences compared to western populations." iMeta4: 70014. https://10.1002/imt2.70014.

作者简介

王琼（第一作者）

● 南方医科大学南方医院泌尿外科医师，现任广东省基层医药学会下尿路疾病专业委员会委员。

● 研究方向为嵌合RNA调控前列腺癌进展机制研究。近3年主持国家自然科学基金1项，广东省自然科学基金2项、中国博士后基金面上项目1项。以第一作者/通讯作者（含共同）在iMeta、Advanced Science、International Journal of Surgery、Journal of Experimental & Clinical Cancer Research、Npj Precision Oncology等高水平期刊共发表SCI论文20余篇，Google scholar总被引近1000次。

于顺利（第一作者）

● 中山大学博士研究生。

● 研究方向为嵌合RNA对前列腺癌调控的机制研究。以第一/共同第一作者在iMeta、ACS Biomaterials Science & Engineering等杂志发表SCI论文3篇。

揭济榕（第一作者）

● 南方医科大学，在读博士研究生。

● 研究方向为嵌合RNA对前列腺癌调控以及膀胱癌转移相关分子机制研究。以共同第一作者在iMeta期刊发表SCI论文。

黄海（通讯作者）

● 中山大学教授、主任医师、博导，孙逸仙纪念医院泌尿外科党支部书记、副主任，外科副主任。

● 研究方向为泌尿系统肿瘤的诊治，在前列腺癌肿瘤的研究领域贡献突出。主持国自然基金5项，国家重点研发计划重点专项1项，广东省重点国际合作2项，广州市重点2项，省自然、省科技10余项，牵头主持多中心临床研究10余项，在研经费三千余万。第一、通讯发表SCI论文60余篇，总影响因子507分，中华系列30余篇，曾多次国际、国内会议大会发言。

李辉（通讯作者）

● 弗吉尼亚大学终身教授,冠名杰出教授,弗吉尼亚大学RNA科学与医学中心创始主任, 弗吉尼亚大学癌症中心项目主任。

● 研究方向为嵌合RNA在肿瘤发生发展分子机理研究和靶向药物研发。主持完成多项NIH , AACR课题，是融合基因领域全球领军人物。获得过Stand Up To Cancer Innovator Award、AACR、St.Baldrick’s Schloar、V Scholarship、IVY Foundation、Harrison Distinguished Teaching Professor of Pathology、Pinn Scholar等多项大奖。在Science、Cancer Discovery、PNAS、Nature Communications、iMeta、Nucleic Acids Research 等高水平杂志发表过多篇开创性文章，多次被EurekAlert/AAAS, Sicence Daily等多家知名媒体跟踪报道。

高旭（通讯作者）

● 医学博士，教授，主任医师，博士生导师。现任海军军医大学附属长海医院泌尿外科副主任，长海达芬奇机器人国际培训中心副主任。

● 主要研究方向前列腺癌的早期诊断、优化治疗和全程管理。作为主要完成人获得9项省部级以上奖项，2012年获得国家科技进步一等奖、2015年获得国家科技进步二等奖、2009年获得上海市科技进步二等奖。作为第一申请人，获得国家自然科学基金等8项前列腺癌研究领域科研基金，总资助强度764万元。近年以通讯或第一作者发表SCI论文9篇，主编、副主编专著3部，获得国家发明专利1项，实用新型专利2项，国家软件著作权4项。

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1卷1期

1卷2期

1卷3期

1卷4期

2卷1期

2卷2期

2卷3期

2卷4期

3卷1期

3卷2期

3卷3期

3卷4期

3卷5期

3卷6期

4卷1期

iMetaOmics封面

1卷1期

1卷2期

2卷1期

期刊简介

“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！

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来源：微生物组