摘要：X-射线衍射技术是鉴定蛋白质结构的金标准。XRD可以实现较高的分辨率，通常可以达到1到2Å。因此，它可以提供非常详细的原子级别的结构信息。这其中蛋白质晶体的生长对XRD来说是⼀个很大的挑战，因为不是所有蛋白质都能够形成高质量的晶体。
01
X射线衍射简介
X-射线衍射技术是鉴定蛋白质结构的金标准。XRD可以实现较高的分辨率，通常可以达到1到2Å。因此，它可以提供非常详细的原子级别的结构信息。这其中蛋白质晶体的生长对XRD来说是⼀个很大的挑战，因为不是所有蛋白质都能够形成高质量的晶体。
原理：当X射线投射到蛋白质晶体样品时，蛋白质分子内部结构受到激发，入射线反射波互相叠加产生衍射波，衍射波含有被测蛋白质构造的全部信息，通过摄影得到一张衍射图，再用电脑进行重组，即可绘出一张电子密度图。从电子密度图可以得到样品的三维分子图象，即分子结构的模型。
在通过蛋白质晶体学解析的结构中，同步辐射晶体学衍射技术占据了相当大的比例。更重要的是，基于同步辐射结构解析的研究工作已获得5 项诺贝尔奖，分别是1997（ATP 合酶结构），2003（离子通道结构），2006（RNA 聚合酶结构），2009（核糖体结构）和2012 年（G 蛋白偶联受体结构）的诺贝尔化学奖。
02
实验流程
1.蛋白样本制备
包括目的蛋白的表达与纯化。后续的蛋白结晶步骤对蛋白的纯度和浓度都有极高的要求，因此，获取的目的蛋白需要足量，纯度高，才能保证后续实验顺利进行。
2.蛋白质结晶筛选
蛋白质结晶是支持蛋白质结构研究的第一步，也是最难的一步。目前为止，蛋白质结晶没有通用的方法，更加依赖于实验人员的经验，通常需要对非常多的条件来进行筛选和优化。目前市场上有支持蛋白质晶体初筛的试剂盒，之后根据蛋白结晶的情况对其进行二次条件优化，最终得到高质量的蛋白晶体。
常规的蛋白质结晶方法有：分批结晶法、液-液扩散法、蒸汽扩散法（悬滴法、坐滴法）等。根据不同的需求，可区分为蛋白的单体结晶和蛋白与配体的共结晶。
3. 晶体衍射数据收集
进行X射线衍射分析需要有X射线源，目前使用较多的是旋转阳极铜靶作为X射线光源，更强的X射线是由同步辐射加速器产生的。将获得质量好的晶体带至上海光源，晶体迅速冻于液氮中，然后把晶体安装至X射线衍射仪上，根据晶体的性质选择合适的曝光时间或者与曝光仪之间的距离，衍射点尽量保证是独立存在且清晰可见，晶体衍射图的帧数收集得越多越好，后期解析结构可能需要足够多的衍射图才能把特定空间群里的晶体结构解析出来。
4 结构解析
解析蛋白质晶体结构的步骤已经规范化了，但需要晶体结构解析软件的辅助，常见的有DENZO、CCP4, Phenix, XDS和HKL-2000/300。
5.结构分析
晶体结构解析完毕，仅获得PDB文件的文本信息，需要使用软件呈现蛋白质的晶体结构，以便于蛋白质晶体结构的分析及作图。常见的蛋白质晶体结构可视化软件有PyMOL, UCSF Chimera和VMD。
03
在结构生物学领域的应用
案例1：亚胺还原酶（IREDs）
亚胺还原酶（IREDs）是依赖NAPDH的酶，可催化亚胺的不对称还原合成手性胺。但IREDs的底物范围很窄，合理的工程设计非常罕见。
2022年，中国科学院微生物研究所高书山团队在国际顶尖学术期刊《Angewandte Chemie》上发表了一篇关于亚胺还原酶IR-G36结构设计的论文。该文章运用了半理性设计手段对酶进行改造。首先在86个IREDs中进行筛选，筛选出具有最佳R选择性（78%）的IR-G36作为下一步进化的目标。接着运用结构生物学的手段，解析IR-G36的空间结构作为酶改造的依据，最终成功改造出催化效率大大提高的变体M5。
本研究中关于IREDs结构解析方面的工作由苏州青云瑞晶科技有限公司提供技术支持。
图1. IR-G36 WT与辅助因子NADP+复合的三维结构
以IR-G36 WT的结构作为模型，利用分子置换法确定IR-G36 M5的结构。
图5. IR-G36 WT（灰色）的结构和IR-G36 M5（小麦色）的结构重叠
案例2：膜蛋白
生物基因组编码的蛋白质中，整合膜蛋白约占30%；而一半以上的药物作用靶点，都是膜蛋白。因此，膜蛋白相关研究具有极其重要的生物学和医学意义。膜蛋白结构解析的难点在于不易得到足量稳定有活性的蛋白，进一步的结晶更加困难。尽管冷冻电镜的技术进步已经革新了整个结构生物学领域，然而对于较小的膜蛋白（100 kDa 或更小）仍然困难，其结构精度也尚未普遍达到晶体学的高分辨水平。
2020年，圣路易斯华盛顿大学栗卫凯课题组在 Science Advances杂志上发表了小分子膜蛋白的末端约束可在近原子分辨率下确定结构的研究论文，实现了对较小的膜蛋白晶体结构解析方法的研究突破。
图3. 基于末端约束法的晶体衍射和相位改进
04
X射线衍射等结构解析技术平台
「青云瑞晶」提供专业的结构解析技术服务，目前已完成750+结构解析项目，储备了250+靶点蛋白结晶条件和结构数据，项目经验丰富。公司自拥有单晶X射线衍射（XRD）、冷冻电镜单颗粒法（CryoEM-SPA）、MicroED 三种结构解析技术平台，根据蛋白质的不同性质，提供不同的解决方案，结合精良高端的实验设备、经验丰富的高学历科研团队，为您提供从蛋白表达开始的一站式结构解析服务，灵活多样化满足您的多种科研及工业界需求。
------ -------
参考文献
[2]Shixuan Liu et al. ,Termini restraining of small membrane proteins enables structure determination at near-atomic resolution.Sci. Adv.6,eabe3717(2020).DOI:10.1126/sciadv.abe3717
来源：青云瑞晶