摘要：二岩藻糖基乳糖（Difucosyllactose，DFL）是母乳低聚糖（HMO）的重要组成部分，属于最简单的 HMO。研究已证实，DFL 是一种典型的岩藻糖基化 HMO，不仅能促进新生儿的生长发育，还具有重要的抗菌活性。鉴于这些功能性特点，DFL 已被 FDA
二岩藻糖基乳糖（Difucosyllactose，DFL）是母乳低聚糖（HMO）的重要组成部分，属于最简单的 HMO。研究已证实，DFL 是一种典型的岩藻糖基化 HMO，不仅能促进新生儿的生长发育，还具有重要的抗菌活性。鉴于这些功能性特点，DFL 已被 FDA 和欧洲食品安全局等认证并批准为新型食品添加剂或成分。
因此，如何更高效和安全生产 DFL 成为了当下的研究热点。与其他方法相比，利用微生物细胞工厂合成 DFL 具有成本低、安全、快捷和环保等特点，有潜力成为大规模生产 DFL 的可行方法。目前 DFL 的微生物合成主要依赖质粒表达系统，但质粒稳定性差、抗生素依赖等问题制约了其工业化进程。
近日，江南大学沐万孟团队通过多维度代谢工程策略，成功构建出高效生产 DFL 的工程菌株 MGA2S-5。该菌株在 7 L 生物反应器中实现了 35.04 g/L 的 DFL 产量，且全程无需添加抗生素，为安全、稳定的工业化生产提供了新方案。相关成果以“Multidimensional Engineering of Escherichia coli MG1655 for the Efficient Biosynthesis of Difucosyllactose”为题发表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry 。
研究团队以无质粒大肠杆菌 MG1655 为底盘细胞，利用 CRISPR-Cpf1 基因编辑技术，将 α1,2-岩藻糖基转移酶（SAMT）和 α1,3-岩藻糖基转移酶（Fut3Bc）直接整合至染色体。SAMT 负责将乳糖转化为中间体 2'-岩藻糖乳糖（2'-FL），Fut3Bc 则进一步催化 2'-FL 生成 DFL。通过消除质粒依赖，菌株的遗传稳定性显著提升，同时避免了抗生素使用带来的安全风险。
图 | 工程化大肠杆菌 MG1655 中 DFL 的从头生合成途径
研究进一步优化了基因拷贝数配比，以平衡代谢流的分配。实验表明，染色体中插入 2 拷贝 SAMT 与 4 拷贝 Fut3Bc 突变体（F24Y）时，代谢流分配最为均衡。此配置不仅减少了中间产物 2'-FL 的积累，还将 DFL 产量最大化。最终菌株 MGA25-5 在摇瓶发酵中，DFL 产量达 4.00 g/L，较未优化菌株提升近 4.9 倍。
尽管基因组整合解决了质粒稳定性问题，但野生型Fut3Bc的催化效率仍是限速步骤。Fut3Bc 负责催化 2'-FL的 C3 位岩藻糖基化反应，而野生型 Fut3Bc 在底物结合与催化活性上仍有优化空间。因此，研究团队结合 AlphaFold 3 结构预测与 HotSpot Wizard 活性位点分析，对 Fut3Bc 进行定向进化。通过丙氨酸扫描筛选出关键位点 Phe24（F24），该残基与底物 2'-FL 形成关键氢键。饱和突变实验发现，F24Y 突变体（苯丙氨酸突变为酪氨酸）能显著增强底物结合能力，分子对接显示 F24Y 突变使酶与底物的相互作用更稳定，同时优化了催化口袋的空间结构，其与 2'-FL的结合能降低至 2.4 kJ/mol，催化效率较野生型提升 1.6 倍。
图 | AlphaFold3 模拟的关键限速酶 Fut3Bc 的晶体结构
尽管研究团队通过无质粒策略构建了工程菌株，并优化了关键酶 Fut3Bc（F24Y）的催化性能，但在初步发酵实验中仍然发现了底物利用效率不均衡的问题：2'-FL 在某些条件下仍然会积累，而 DFL 的合成速率并未达到理论最优值。为此团队从两方面优化代谢网络：其一，动态调控乳糖补料速率（2-3 g/L/h），避免 2'-FL 过量堆积；其二，强化 GDP-L-岩藻糖合成途径，通过替换 manA、manB、manC、gmd 和 fcl 基因的天然启动子为强启动子（Ptac70 和 PJ23119），显著提高了岩藻糖供体的供给效率。
在 7 L 生物反应器中，MGA25-5 展现出卓越性能：发酵 46.8 h 时 DFL 产量达 25.30 g/L，最终在 63.5 小时突破 35.04 g/L，生产效率为 0.66 g/L/h，且发酵液中未检测到残留中间产物。与既往研究相比，该菌株在产量、生产强度与产物纯度上均实现突破。例如，质粒依赖型菌株 CS-10 虽曾报道 53.15 g/L 产量，但残留 6.86 g/L 2'-FL，而 MGA25-5 在相同发酵时间内产量高出 35%，且完全消除副产物。这一结果表明，优化酶拷贝数、增强前体供应和精准调控底物投料，是提升 DFL 合成效率的关键策略，也为未来母乳低聚糖的高效生物合成提供了重要借鉴。
该研究通过多维工程策略，将无质粒合成生物学与计算机辅助设计相结合，为 DFL 的工业化生产提供了安全高效的技术路径。未来团队计划进一步优化菌株的底物耐受性与鲁棒性，并探索智能调控策略以适应更大规模发酵。此外，该平台技术可扩展至其他高附加值母乳低聚糖（如 LNT、LNnT）的生物制造，为功能性食品与医药领域注入创新动力。
参考链接：
1.Chen Y, Zhao C, Wang R, Zhang W, Zhu Y, Mu W. Multidimensional Engineering of Escherichia coli
MG1655 for the Efficient Biosynthesis of Difucosyllactose. J Agric Food Chem. 2025;73(9):5405-5413. doi:10.1021/acs.jafc.4c12623
免责声明：本文旨在传递合成生物学最新讯息，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
来源：生辉SciPhi