单细胞测序高分论文发表的可靠技术路线指南

摘要：该文章构建了多种人类肿瘤类器官及 3D 培养模型，系统探究癌症发生发展的内在机制，涵盖胰腺癌氧化还原稳态调控、癌基因 Ras 信号传导路径解析等方向，旨在发掘胰腺癌早期诊断标志物，并阐明胰腺癌细胞与肿瘤基质细胞的交互作用机制。

跨物种单细胞测序揭示具有抗原提呈功能的肿瘤相关成纤维细胞新亚群（apCAF）

该研究成果发表于《Cancer Discovery》（影响因子 29.497）。

该文章构建了多种人类肿瘤类器官及 3D 培养模型，系统探究癌症发生发展的内在机制，涵盖胰腺癌氧化还原稳态调控、癌基因 Ras 信号传导路径解析等方向，旨在发掘胰腺癌早期诊断标志物，并阐明胰腺癌细胞与肿瘤基质细胞的交互作用机制。

在肿瘤研究领域单细胞测序技术广泛应用的背景下，作者通过功能验证发现新型 CAF 亚群，成功切入肿瘤免疫研究热点，为靶向药物研发及个体化治疗策略提供了创新性思路。

1. 研究背景

胰腺导管腺癌（PDAC）具有高病死率、差预后的临床特征，对常规治疗应答不佳，其病理特征表现为以 CAF 为代表的大量非恶性基质细胞浸润。早期研究已发现促肿瘤型 CAF，且敲除小鼠体内 CAFs 会促进肿瘤转移。
作者前期已鉴定出炎症型 iCAF 和肌纤维母细胞型 myCAF，为深入解析 PDAC 异质性，通过单细胞转录组测序发现一类高表达 MHC class II 和 CD74 的新型 CAF 亚群，将其命名为 apCAF（antigen-presenting CAFs）。

2. 思路模块

正文共包含 7 组图，可划分为三个研究板块：第一板块为人类 PDAC 基质细胞及 CAFs 亚群特征描述（Fig.1~3）；第二板块在小鼠及人源组织中鉴定 apCAF 亚群（Fig.4~6）；第三板块通过小鼠模型开展 apCAF 亚群的功能验证（Fig.7）。

3. 数据解读

Fig.1 单细胞测序鉴定人源 PDAC 组织中的胰管细胞亚群

课题组采集 6 例 PDAC 组织及 2 例癌旁对照样本，累计获取 21,200 个细胞。通过流式细胞术分选 CAFs 与非 CAFs 细胞群（图 1A），基于 t-SNE 算法进行降维分析得到 15 个细胞集群，发现基质细胞以髓样细胞和淋巴样细胞为主（图 1B），并进一步展示各细胞类群对应的特异性标志物（平均 5246 个转录本，1576 个基因；图 1C）。

在人源 PDAC 组织中鉴别出四群胰管细胞，其中第 2 群源自正常组织，其余 3 群主要来源于肿瘤组织（图 1D-E）。图 1F 展示各群胰管细胞的特异性标志物。通过通路分析（1、3、4 群 vs 2 群），富集到 KRAS、p53 及缺氧信号通路，与肿瘤生物学特征一致。

Fig.2 人源 PDAC 免疫抑制微环境的功能解析

对髓样细胞进行降维分析后，发现以单核巨噬细胞为主的细胞集群（图 2A），其中第 4 群（替代性活化巨噬细胞）全部来源于肿瘤组织，且显著高表达 SPP1、LY6E、MARCO 等免疫抑制因子（图 2B-C）。进一步研究发现单核巨噬细胞同时表达粒细胞标志物，提示髓样细胞具有高度异质性（图 2D）。

在 T 细胞与 NK 细胞群体中，经降维分析识别出 5 个细胞群，以 T 细胞为主。其中第 3 群（Treg 细胞）全部来源于肿瘤组织，高表达 CTLA4、TIGIT 等免疫抑制因子；此外检测到 T/NK 细胞耗竭标志物，提示其参与肿瘤免疫抑制微环境构建（图 2E-H）。

Fig.3 人源 PDAC 组织中 CAFs 亚群的分型验证（前期研究成果）

作者对 962 个 CAFs 的标志物进行分析，通过降维处理鉴别出 iCAFs 和 myCAFs 两个细胞亚群（图 3A-B）。

Pan-CAF 特异性表达 COL1A1、FAP、PDPN、DCN 及 VIM（图 3C）；iCAFs 高表达 CXCLs、CCLs 等炎症及趋化因子；myCAFs 则高表达 αSMA（ACTA2）等标志物（图 3D-E）。

进一步分析 CAFs 内异常激活的分子通路，发现 iCAFs 差异表达 IL1R1、STAT3 等基因，myCAFs 差异表达 TGFBI、SMAD2 等分子（图 3F-I）。

Fig.4 KPC 小鼠 PDAC 组织中新型 CAFs 亚群（apCAF）的发现

研究团队构建 4 只 KPC 小鼠模型，获取 11,260 个细胞，经 t-SNE 降维分析得到 12 个细胞群，基质细胞以巨噬细胞和中性粒细胞为主（图 4A）。

图 B 展示各细胞类群对应的特异性标志物（平均 5989 个转录本，1916 个基因）。在 4012 个 CAFs 中识别出 iCAF、apCAF 和 myCAF 三个亚群，其中 apCAF 异常激活 H2-Ab1 和 Cd74 基因，编码 MHC-II 分子（图 4C~H）。

Fig.5 KPC 小鼠组织中 apCAF 亚群的鉴定

在图 5A~D 中，作者通过 RNA 原位杂交检测 Col1a1（pan-CAF 标志物）和 H2−Ab1（apCAF 标志物），免疫组化（IHC）检测 PDPN（pan-CAF 标志物）和 CD74（apCAF 标志物），并通过流式细胞术分选出 iCAF、apCAF 和 myCAF 三个亚群。

其中 apCAF 高表达 H2−Ab1、Cd74、Slpi 和 Saa3（图 5E），iCAF 高表达 Cxcl12、Pi16 和 Il6（图 5F），myCAF 高表达 Acta2 和 Tgfb1，验证了前期测序结果（图 5G）。

Fig.6 人源 PDAC 组织中 apCAF 亚群的鉴定

作者检测人源 CAFs 中编码 MHCII 的基因 HLA-DRA、HLA-DPA1 和 HLA-DQA1，pan-CAF 标志物 Col1a1，以及小鼠 apCAF 标志物 CD74、SLPi，发现 20.9% 的人源 CAFs 同时表达 CD74 和 HLA-DRA（图 A~C）。

图 D 通过成像质谱流式（Imaging mass cytometry）检测到人源 PDAC 组织中 pan-CAF 标志物 Col1a1（绿色）、apCAF 标志物 CD74 和 HLA-DR（白色），且不表达 CD45（红色）或 EPCAM（紫色）。

Fig.7 apCAF 的抗原提呈功能激活 CD4+T 细胞

对 KPC 小鼠进行 2-D 培养后，发现 apCAF 丢失 MHCII 相关标志物，获得 myCAF 标志物，提示 CAFs 发生亚群转化（图 7A）。

在 T 细胞激活实验中，作者构建原位类器官 KPC 小鼠模型用于分选 CAFs 和 APCs，另构建 OVA 特异性激活的 TCR 小鼠模型，分选 CD4+T 细胞进行共培养，通过流式细胞术检测共培养结果（图 7B-C）。

结果显示，APCs+OVA 组可诱导产生更多 CD69+T 细胞，apCAF+OVA 组具有类似效应但强度低于前者，而 myCAF 或 iCAF 无法激活 T 细胞（图 7D）。apCAF、myCAF 和 iCAF 均不表达协同刺激分子，提示其与传统 APC 激活 T 细胞的机制存在差异（图 7E）。

4. 文章小结

跨物种单细胞测序揭示具有抗原提呈功能的肿瘤相关成纤维细胞新亚群，其技术路线为：临床样本→单细胞 RNAseq→数据建库→表达矩阵→降维分析→细胞类群注释→下游功能验证。

研究主要发现包括：apCAF 亚群及其特异性标志物的鉴定、apCAF 的抗原提呈功能验证、CAFs 亚群间的动态演化关系。然而，apCAF 介导肿瘤免疫的内在分子机制及靶向 CAFs 亚群的个体化治疗策略仍需深入探索。

近年来，单纯依靠单细胞测序发表高水平论文的难度逐年增加，科研工作者逐渐将测序分析与后续功能验证相结合。若能结合空间转录组技术分析细胞亚群的空间定位，将为相关功能研究提供更坚实的理论基础。

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