摘要：艰难梭菌(Clostridioides difficile)能够短暂或长期定殖于人类肠道，并可能引发感染风险。这一过程受到人类肠道微生物群中复杂的分子与生态相互作用的深刻影响。通过研究艰难梭菌在人体肠道群落中经历数百代的动态变化，我们发现其定殖模式包括稳定共存
● 期刊：Cell Host & Microbe(IF:20.6)
● DOI：https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.12.001
●原文链接: https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00446-3
● 第一作者：Jordy Evan Sulaiman
● 通讯作者：Ophelia S. Venturelli（ophelia.venturelli@duke.edu）
● 发表日期：2025-1-8
● 主要单位：
美国威斯康星大学麦迪逊分校、美国杜克大学
摘要Summary
艰难梭菌(Clostridioides difficile)能够短暂或长期定殖于人类肠道，并可能引发感染风险。这一过程受到人类肠道微生物群中复杂的分子与生态相互作用的深刻影响。通过研究艰难梭菌在人体肠道群落中经历数百代的动态变化，我们发现其定殖模式包括稳定共存、不稳定性或竞争性排除。降低碳水化合物浓度使包含艰难梭菌和常见肠道共生菌普通拟杆菌的群落从竞争性排除转变为共存，而这种转变得益于交互喂养的增强。在这种环境下，艰难梭菌发生了两处关键突变，使其代谢生态位从依赖脯氨酸转向依赖葡萄糖。这些代谢改变显著影响了艰难梭菌与肠道微生物群的种间相互作用，同时降低了小鼠的疾病的严重程度。综上所述，与普通拟杆菌的相互作用在塑造艰难梭菌的长期生长动态和进化适应中发挥了关键作用，为制定针对艰难梭菌的防治策略提供了重要启示。
结果Results
人类肠道菌种在群落中对艰难梭菌的长期生长具有差异性影响
艰难梭菌(C. difficile)可在不同生命阶段的个体中定殖，持续时间各不相同，而人们对决定这些动态的因素仍然知之甚少。由于肠道微生物生态是艰难梭菌定殖的重要决定因素，我们采用了自下而上的微生物群落实验，研究种间相互作用如何塑造艰难梭菌的长期生长动态。为此，我们将艰难梭菌 DSM 27147(流行性核型 027 的参考菌株 R20291)与 9 种多样的人类肠道菌种共同培养在支持其生长的特定培养基中(图 1A 和 S1A；表 S1 和 S2)。这些人类肠道菌种在不同个体中高度普遍存在，并涵盖了人类肠道微生物群的系统发育多样性。该群落包括以下物种：闪烁梭菌(Clostridium scindens, CS)：此前研究表明其在无菌小鼠中可抑制艰难梭菌的生长；梭菌(Clostridium hiranonis, CH)：通过代谢生态位重叠抑制艰难梭菌，并导致其代谢发生显著变化；拟杆菌属物种(包括单形拟杆菌(Bacteroides uniformis, BU)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron, BT)和普通拟杆菌(Phocaeicola vulgatus, PV)：在不同环境下可抑制或促进艰难梭菌的生长。此外，脱硫弧菌(Desulfovibrio piger, DP)、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta, EL)、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens, CA) 和 普雷沃菌(Prevotella copri, PC) 与艰难梭菌的相互作用也已在短时间尺度(约 5–10 代)内得到广泛研究。
图1 | 艰难梭菌在人类肠道群落中的长期生长动态
(A)艰难梭菌在人类肠道群落中长期生长实验示意图。根据每个物种的 16S rRNA 序列生成了系统发育树。
(B)利用时间序列绝对丰度数据推断 gLV 模型参数。
(C)利用 35 次传代的丰度数据推断出艰难梭菌与 9 种肠道菌种之间的长期种间相互作用网络。节点大小代表物种的环境容纳量，边的宽度代表长期种间相互作用系数(aij)的大小。肠道菌种之间的完整 aij 见图 S3A。
(D)艰难梭菌与肠道细菌在成对(左)和三成员(右)群落中的代表性群落动态。由彩色线条连接的数据点表示每个物种的相对丰度(左 y 轴)，而带有 95%置信区间阴影的灰色线条表示群落 OD600(右 y 轴)。完整的群落动态见图 S1C(成对)和图 S2A(三成员)。稳定共存、不稳定共存和竞争排斥的分类依据图 S2B。(E)使用最后一个时间点相对于初始时间点的香农多样性来测量所有包含 x 轴所示特定物种的成对和三成员群落中共存程度(ΔH)。
(F)在所有包含 x 轴所示特定物种的成对和三成员群落中，35 次传代过程中各时间点测量值之间欧几里得距离的箱线图。对于(E)和(F)，由于组间重叠群落的存在，某些数据点跨越了较大的多样性空间，从而导致了变异性(示例数据点已突出显示)。图上方的星号表示该组与另一组之间双向曼 - 惠特尼 U 检验的统计学显著 p 值，星号颜色与另一组对应。*p
我们组装了所有可能的双物种组合(共9种)和三物种组合(共36种)，其中包含艰难梭菌(C. difficile)和肠道细菌。这些菌群培养了24小时后，取少量样品以40倍稀释接种至新鲜培养基，连续传代35次(约186代)(详见STAR方法)。通过16S rRNA测序确定每种物种的相对丰度，并乘以各时间点的总生物量，估算每种物种的绝对丰度。此外，我们单独培养了每种物种，采用相同的实验设计(图S1B)。结果显示，艰难梭菌在60%的群落中持续存在(相对丰度 >1%，直到最后一次传代)，包括7/9的双物种群落和20/36的三物种群落(图S1C和S2A)。然而，在84%的群落中，艰难梭菌的绝对丰度从初代到最后一次传代显著下降(图S1D)。某些物种(如PC和BT)在明显抑制艰难梭菌的群落中被显著富集。所有拟杆菌属(Bacteroides)物种在单一培养或与艰难梭菌共培养时均显著降低了培养基的pH值(培养基pH从7.1降至约4.9–5.3；图S1E)。虽然其他肠道菌在单一培养或共培养中未显著降低pH值，但PC仅在与艰难梭菌共培养时显著酸化了培养基(pH从7.1降至5.1)，这可能与PC对艰难梭菌的抑制效应有关(图S1D)。
为了量化人类肠道菌种对艰难梭菌长期生长的影响，我们采用广义Lotka-Volterra(gLV)模型，对单一培养、双物种和三物种群落在35次传代中的物种丰度时间序列数据进行了拟合(图1B；表S3 DATASET001；详见STAR方法)。gLV模型是一种动态生态模型，可根据各物种的生长和与群落成员的双物种相互作用预测群落动态。该模型广泛用于解析物种间相互作用并预测不同环境中的群落组装过程。推导出的gLV物种间相互作用系数量化了特定物种对另一物种长期生长的影响(图S3A)。模型与实验数据的拟合度较高(Pearson相关系数R = 0.89–0.91，p = 3.6E−42至2.3E−51；图S3B)。为了评估模型对验证数据的预测性能，我们进行了留一交叉验证(图S3C；详见STAR方法)。由于用于训练模型的数据有限，特别是肠道菌的相关数据，模型仅对艰难梭菌的丰度预测表现出中等一致性(艰难梭菌的Pearson相关系数R = 0.36–0.60，总体相关系数R = 0.63–0.70，p = 1.5E−13至1.9E−18)。此外，gLV模型未能捕捉物种间相互作用的进化变化，这可能是预测性能较低的原因之一。
与基于艰难梭菌(C. difficile)在人类肠道群落中短时间尺度测量推导出的gLV物种间相互作用网络(主要以负相互作用为主)相比，长期生态相互作用推导出的网络显示出较高频率的正相互作用(图1C)。在这一时间尺度上，PV和DP与艰难梭菌之间表现出双向正相互作用，而理论上这可能会导致群落动态的不稳定性(图1D，图S1C，图S2A和图S2B)。相反，EL与艰难梭菌之间表现出输出正相互作用和输入负相互作用。这种拓扑结构可能形成负反馈回路，从而稳定群落动态，并解释了观察到的EL与艰难梭菌之间的稳定共存现象。
然而，经常排斥艰难梭菌的物种(如PC和BT)也显示出与艰难梭菌之间的输出负相互作用和输入正相互作用。这与竞争性排除动态的稳定性相一致(图S2B)。CS和CH在双物种共培养中被艰难梭菌在7次传代后竞争淘汰，并且经常被三物种群落排除(图S1C，图S1F和图S2A)，这与来自艰难梭菌的输入负相互作用一致。
为了评估群落中物种共存的程度，我们计算了香农多样性指数的变化(ΔH)(图1E)。含有EL和CA的群落表现出较高的ΔH，而含有BT的群落则表现出最低的ΔH。此外，我们通过计算各时间点之间物种相对丰度的欧几里得距离，量化了群落动态的变异性。较大的欧几里得距离值及其更广的分布范围表明群落不稳定性增加。PV和DP的存在使欧几里得距离增加，与其他物种相比，其双向正相互作用的网络拓扑可能导致群落动态的不稳定性(图1F)。
我们研究了在较长时间尺度和不同环境条件下与艰难梭菌(C. difficile)共存的一部分群落的动态。具体而言，我们将包含CA、EL、BU、DP和PV的双物种群落，与两种不同的艰难梭菌菌株分别在三种不同培养基条件下共培养了341代(图S4A–S4D)。由于艰难梭菌在不同菌株之间具有很大的遗传变异性，研究中选择了一个具有毒素的DSM 27147菌株和一个非毒素的MS001菌株，后者具有更大的基因组和独特的代谢能力。此外，我们通过修改基础培养基降低碳水化合物浓度(降至原来的1/4)或提高氨基酸浓度(增加至原来的2倍)。减少碳水化合物浓度可能通过改变竞争强度和/或某些肠道菌种导致的培养基酸化来影响艰难梭菌的生长；而增加氨基酸浓度可能通过增强Stickland代谢促进艰难梭菌的生长。该代谢途径通过偶联氨基酸的氧化和还原产生有机酸，为能量和生长提供支持。
在大多数群落和营养环境中，艰难梭菌DSM 27147和MS001表现出相似的长期动态(图S4E–S4G)。相比之下，CD-PV和CD-DP的动态在时间上表现出更大的不稳定性，并且在不同营养环境下的变化幅度大于其他群落(图S4E–S4J)。
总之，EL在长时间尺度内促进了艰难梭菌在群落中的稳定共存。相反，PV或DP的存在在不同环境条件下引发了群落动态的不稳定性。这些动态总体上与其推导的相互作用网络拓扑一致。
资源受限的环境促进了艰难梭菌与PV的交叉喂养和共存
已有研究表明，人类结肠中约30%的细菌属于拟杆菌属(Bacteroides)，其中PV、BT、BU、B. distasonis、B. fragilis和B. ovatus在个体间的普遍性最高。除此之外，拟杆菌属的定植稳定性已被多次验证。尤其是，PV因其较高的定植能力，被视为治疗复发性艰难梭菌感染(rCDI)的潜在活菌疗法候选菌株。研究艰难梭菌与这些肠道微生物中高度丰度且稳定的成员之间的相互作用，可以为揭示影响艰难梭菌定植的因素提供重要见解。
在CD-PV共培养中观察到一个独特现象：营养环境的改变可以在一定时间范围内将群落动态从竞争性排除转变为共存。在高浓度碳水化合物环境下，艰难梭菌在约186–224代时被排除；而在降低碳水化合物浓度的培养基中，艰难梭菌与PV共存了341代(图S4E和S4F)。
为揭示这些条件下驱动共存与竞争性排除的代谢活动，我们对PV和艰难梭菌在两种培养基中的代谢产物进行了外代谢组学分析，通过测量培养液上清液中代谢物的浓度变化(起始时和培养24小时后，见图2A和2B)。在单菌培养中，艰难梭菌利用其司提克兰氏反应(Stickland)代谢能力，消耗了培养基中的多种氨基酸。在低碳水化合物培养基中，PV释放了艰难梭菌利用的84%的代谢物，包括用于Stickland代谢的氨基酸。在PV单菌培养中，这些代谢物在24小时内呈现递增趋势；但在CD-PV共培养中，这些代谢物在约6到12小时后呈现下降趋势，表明它们被艰难梭菌消耗。因此，这些结果支持了PV向艰难梭菌跨物种供给多种代谢物的现象(图2A和图S5)。
相比之下，在高碳水化合物浓度下，预测的跨物种供给较少，艰难梭菌利用的代谢物中仅有12%由PV释放(图2B和图S6)。此外，PV在单菌培养中消耗了艰难梭菌利用的24%的代谢物，包括葡萄糖和肌醇，表明在这种培养基条件下资源竞争占主导地位。在高碳水化合物培养基中，艰难梭菌利用的代谢物中，有45%也在低碳水化合物培养基中被利用。这表明改变碳水化合物浓度调节了艰难梭菌的代谢生态位。
图2 | 两种营养环境中艰难梭菌和普通拟杆菌的外代谢组学分析
(A 和 B) 艰难梭菌在基础培养基中消耗的代谢物相对于空白培养基(t = 0 h)的倍数变化热图，分别在降低碳水化合物浓度的培养基(低碳水化合物培养基，A)和基础培养基(高碳水化合物培养基，B)中展示。完整的代谢组学分析见图S5(低碳水化合物培养基)和图S6(高碳水化合物培养基)。时间变化的丰度测量图来自图S4E和S4F。
(C 和 D) 有机酸在低碳水化合物培养基(C)和高碳水化合物培养基(D)中的定量分析(均值 ± 标准差，n = 3)。水平虚线表示空白培养基中检测到的浓度。未配对双侧 t 检验的 p 值也已标注。
(E 和 F) CD-PV 共培养中主要代谢活动的示意图，分别在低碳水化合物培养基(E)和高碳水化合物培养基(F)中进行展示。部分图形使用 Biorender 制作。
通过对其他8种人类肠道细菌在高碳水化合物培养基中的单菌培养进行代谢组学分析，我们发现，在这种环境中，艰难梭菌与肠道细菌之间的潜在交叉喂养总体上较为稀少。具体来说，其他肠道物种释放的代谢物中，只有约3%–15%被艰难梭菌单菌培养利用(图S6G)。在9种肠道细菌中，CS和CH与艰难梭菌的代谢物利用重叠率最高(分别为61%和36%，图S6E和S6G)，可能在司提克兰氏反应的氨基酸上与艰难梭菌竞争。这种潜在的资源竞争与它们在与艰难梭菌共培养中的灭绝情况一致(图S1C和S1F)，因为CS和CH的生长速率也低于艰难梭菌(图S6H–S6J)。
除了交叉喂养，这种共存还可能通过利用非重叠资源来实现。在高碳水化合物培养基中，艰难梭菌消耗的代谢物中有21%是独特的(图S6B)，这表明正交生态位可能使艰难梭菌与某些肠道物种共存。在这些细菌中，艰难梭菌消耗的代谢物种类数量仅次于CS(图S6D)，表明艰难梭菌具有灵活而广泛的代谢生态位。
发酵终产物在肠道微生物组的种间相互作用中起重要作用。因此，除了通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)测量的广泛代谢物组外，我们还量化了艰难梭菌和PV在生长24小时后培养上清液中丁酸、乳酸、乙酸和琥珀酸的浓度(图2C和2D)。这些发酵终产物在肠道中可达到高浓度，并影响人类健康。例如，丁酸是一种有益代谢物，是结肠细胞的主要能量来源，促进肠道稳态，并已被证明可减少小鼠艰难梭菌感染(CDI)的疾病严重程度。尽管艰难梭菌和PV都产生乙酸，但PV产生琥珀酸，艰难梭菌则产生丁酸。在共培养中，琥珀酸浓度显著低于PV单菌培养，而丁酸浓度显著高于艰难梭菌单菌培养(图2C)。这表明艰难梭菌将PV释放的琥珀酸转化为丁酸。从拟杆菌到艰难梭菌的琥珀酸交叉喂养在小鼠中也被观察到，这表明这种代谢交换在哺乳动物肠道中具有重要意义。此外，艰难梭菌产生乳酸并被PV利用，表明代谢物的双向交换(图2C和2D)。总之，这些数据表明，PV和艰难梭菌能够通过多种代谢物的交换进行相互作用。
除了高碳水化合物浓度环境中资源竞争的增强和代谢物交叉喂养的减少外，PV在单菌培养及与艰难梭菌的共培养中显著降低了培养基的pH值(图S7A)。由于研究表明艰难梭菌的生长在低pH条件下会受到负面影响，15 PV引起的培养基酸化可能促进了竞争性排除的动态。在有限碳水化合物培养基中，未观察到培养基酸化，这与艰难梭菌和PV在该环境中的共存相一致(图2A)。
总体而言，碳水化合物有限的环境促进了代谢物交叉喂养以及艰难梭菌和PV之间的共存(图2E)。在高碳水化合物浓度的环境中，资源竞争可能占主导地位，并导致培养基pH显著降低。因此，在与PV的共培养中，艰难梭菌的生长受到抑制，最终在约第35–42次传代后被排除(图2F)。
在与PV长期共培养后艰难梭菌种群中的关键代谢基因出现单点突变
除了生态交互外，艰难梭菌与 PV 的长期共存可能会导致艰难梭菌的进化适应，这对人体肠道可能具有重要意义。为识别在有限碳水化合物培养基中长期共培养后CD-PV群体中出现的突变，我们对第35、49和64次传代(即第186、261和341代)的CD-PV群体进行了全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)。结果在艰难梭菌群体中检测到多个非同义单点突变，突变频率约为14%至97%(图S8A；表S5)。由于突变和遗传漂变的随机性，重复实验的群体未显示完全相同的进化动态。
检测到的非同义突变基因的预测功能与毒力、膜蛋白、ATP结合盒(ABC)转运蛋白和代谢(如磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS)和 Stickland 代谢调控因子)相关。这些基因中的一些在来自健康个体和感染艰难梭菌疾病(CDI)患者的18株分离株中表现出氨基酸变异(图S8B)，表明这些序列变异可能对进化适应有贡献。此外，我们还检测到PV基因组中从第35次到第64次传代出现的多处突变，突变频率约为18%至46%(表S5)。
在艰难梭菌群体中的所有突变中，基因206(G533W)和prdR(A341V)在所有测量的传代中频率都显著增加，并在64次传代后显示出最高频率(图S8A；表S5)。基因206编码一种PTS糖运输子单元IIA，这一基因突变出现在CD-PV共培养的所有三次重复实验中，并在所有突变中显示出最高频率(传代35约56%，传代49可达97%)。相比之下，prdR突变只出现在第49次传代的CD-PV共培养实验的一次重复中(约15%)，并在第64次传代达到约47%。这一现象与基因206在18株自然分离株中氨基酸序列显示出变异相关，而prdR的序列高度保守(图S8B)。因此，prdR的突变可能仅在特定条件下(如基因206突变背景下)发生。prdR是一个核心代谢调节因子，控制丙氨酸和甘氨酸的优先利用，通过Stickland反应产生能量，这对于艰难梭菌的生长和定植至关重要。在丙氨酸存在的情况下，prdR激活编码丙氨酸还原酶的基因的转录，并负调节编码甘氨酸还原酶的基因。以前的研究表明，prdR的缺失会影响艰难梭菌毒素的产生。
为了进一步表征这些单点突变，我们从CD-PV群体最后一次传代中分离出一株携带基因206和prdR两处突变的艰难梭菌菌株(图3A)。WGS验证了这两处突变仅出现在所分离的艰难梭菌菌株(演化菌株)中，而未出现在祖先株中的甘油库存菌株(表S6和S7)。在有限碳水化合物培养基中与PV共培养341代后，演化艰难梭菌菌株趋于接近于等比例，而祖先株的丰度则远离等比例(基于Mann-Kendall检验的显著趋势，图S7B和S7C)。因此，艰难梭菌菌株与PV共存的稳定性高于祖先株。
图3 | 艰难梭菌获得了长期与PV共培养过程中，改变其代谢生态位的进化
(A) 艰难梭菌在与PV共培养的限碳环境中，经过341代分离出来。社区动态的图表来自于图S4F。
(B) 祖代和进化代艰难梭菌株的代谢利用量对数变换的折叠变化热图，与空白培养基相比(n = 3)。与空白培养基相比显著高浓度的代谢物显示在图中(两侧t检验，方差不齐)。星号表示在代谢物释放量之间有显著差异(两侧t检验，p值
(C) 全基因组转录组剖析实验的示意图。
(D) 进化代艰难梭菌株与祖代株转录折叠变化的火山图。每个数据点代表一个单独的基因。虚线表示2倍变化，水平虚线表示由DESeq2的Wald检验计算的统计显著性阈值(贝南明-霍奇伯格多重检验校正，BH调整p值=0.05)。
(E) 选定基因在进化代艰难梭菌株中高表达和低表达的对数变换折叠变化。垂直虚线表示2倍变化。
(F) 当在不同脯氨酸浓度下与PV共培养时，艰难梭菌的丰度。条形图显示了12小时时艰难梭菌的丰度(均值±SD，n = 3)。两侧未配对t检验p值显示在图中。
(G) 进化代艰难梭菌株与祖代株在不同葡萄糖和脯氨酸浓度下的适应性热图。适应性比较通过单培养生长下的曲线下面积(AUC)比率量化(图S11)。星号表示未配对t检验之间的显著性p值。∗p
(H) 进化代艰难梭菌株代谢改变的示意图。
关键的突变在艰难梭菌中显著改变了代谢活动
因为进化型艰难梭菌的突变可能影响代谢活动，我们对高碳水化合物环境下进化型和原始型艰难梭菌菌株的exo-代谢组学特征进行了表征(见图3B和S7F)，以及限碳水化合物环境下的exo-代谢组学特征(见图S5)。尽管原始菌株在代谢方面已知能够利用脯氨酸，但进化型菌株在基础培养基中并未显著消耗脯氨酸(见图3B)。相反，进化型菌株比原始菌株更有效地利用甘氨酸、天冬氨酸和N-乙酰甘氨酸。与此相反，进化型艰难梭菌在限碳水化合物培养基中的单菌种和与PV共培养条件下，脯氨酸的利用率显著降低，其他氨基酸如甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丝氨酸的消耗率显著提高(见图S5D)。此外，在两种培养基条件下，进化型菌株的葡萄糖消耗量也高于原始菌株(见图3B和S5D)。
为了探讨这些突变如何影响艰难梭菌基因表达谱，我们在基础培养基中无PV和有PV条件下，对原始型和进化型艰难梭菌菌株进行了基因组范围转录组分析(见图3C、S9A和S9B)。在3,508个总基因中，89个和55个在进化型艰难梭菌中显著高表达和低表达，分别高于原始菌株(见图3D和3E；表S8)。PTS相关基因，包括突变的基因206，在进化型菌株中显著高表达。这表明，进化型菌株在转运和磷酸化碳水化合物方面适应性更强，促进了如葡萄糖等碳水化合物的高效利用(见图3B)。尽管prdR表达变化不大(1.4倍上调)，但prd和grd操纵子的表达发生了显著变化。特别是甘氨酸还原酶编码基因显著上调(2.1-至305倍)，而脯氨酸还原酶编码基因则显著下调(3.0-至9.7倍)，与原始菌株相比(见图3E)。这一结果与exo-代谢组学结果一致，显示了进化型菌株在脯氨酸和甘氨酸利用方面的变化(见图3B)。
一些代谢基因，如负责Wood-Ljungdahl路径(WLP)碳羰基分支的一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶复合体，能够将CO₂转化为乙酰-CoA，在进化型菌株中比原始菌株高表达(见图3E)。WLP是最重要的能量产生和碳固定代谢之一，其中两个CO₂分子作为终端电子受体被还原为乙酰-CoA，进而转化为乙酸。除此之外，包括thlA1、hbd、crt2(将乙酰-CoA转化为丁酰-CoA)以及ptb和buk(将丁酰-CoA转化为丁酸)的生产丁酸基因在进化型菌株中显著高表达。与这些基因表达模式一致，进化型菌株丁酸生产能力比原始菌株高出2.7倍(见图S9G)。作为一个参考，这种增强的丁酸生产能力(11.6 mM)与在类似培养基中培养的主要丁酸生产菌科普罗科科斯(Coprococcus comes)相当，可能在体内影响疾病严重程度。此外，先前的研究表明某些拟杆菌属显示出对丁酸的营养特异性生长敏感。在3种拟杆菌属中(PV、BT、BU)，只有PV在响应中等浓度的丁酸时显示出显著的生长抑制。进化型菌株产生的丁酸浓度位于PV丁酸-剂量响应曲线的低抑制区域(见图S9H)。
在与PV共培养时，无论是原始菌株还是进化型艰难梭菌菌株均上调了丁酸发酵基因，而进化型菌株的这些基因表达更高(见图S9C–S9E；表S9–S11)。由于培养基中不含丁酸，这表明了PV的交叉喂养现象，与有机酸测量结果的模式一致(见图2C和2D)。值得注意的是，在进化型艰难梭菌菌株存在下，PV显示出了许多与氨基酸生物合成相关的基因高表达，而与原始菌株相比(见图S7B和S9F)。进化型艰难梭菌菌株消耗了比原始菌株更多的氨基酸(甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)(见图S5D)。这表明，PV向进化型艰难梭菌菌株的氨基酸交叉喂养可能比与原始菌株相比得到了增强(见图S7B和S7C)。
进化型艰难梭菌菌株的生长受甘氨酸限制较小，对高葡萄糖浓度表现出增强反应
一个关键未解的问题是，这些代谢适应如何影响艰难梭菌在不同环境中的适应性(fitness)。为了评估适应性变化，我们研究了进化型和祖先型艰难梭菌菌株在不同氨基酸浓度下的生长情况。在氨基酸浓度降低(20%)的早期时间点，进化型艰难梭菌菌株的生长表现出显著的优势，而在其他条件下，两者的生长反应类似(图S7D)。
进化型艰难梭菌菌株的脯氨酸EC50(脯氨酸浓度，能够达到最大生长的50%)显著低于祖先型菌株(图S10A和S10E)。这一结果表明，进化型菌株在低脯氨酸浓度下的竞争效率显著高于祖先型菌株。脯氨酸在我们实验条件下是祖先型艰难梭菌菌株的生长限制资源，这与其他具有多样基因组的艰难梭菌菌株一致。然而，进化型菌株对脯氨酸的需求显著低于祖先菌株，正如我们代谢组学数据(图3B)所示。与这一结果一致，在PV共培养中，进化型菌株的丰度不随脯氨酸浓度变化，这表明其生长处于脯氨酸浓度的饱和状态(图S10G)。相比之下，祖先型菌株的丰度随着脯氨酸浓度的增加而增加(即脯氨酸剂量反应的线性状态)。在低初始脯氨酸浓度下，进化型艰难梭菌菌株在12小时共培养中的丰度高于祖先型菌株，最终在实验结束时下降(图3F)。由于进化型菌株比祖先菌株更能消耗甘氨酸(图3B)，我们还研究了其对不同浓度甘氨酸的生长反应。在单培养(图S10B和S10D)以及共培养PV(图S10H)条件下，进化型和祖先菌株的生长响应显示出类似的趋势。
虽然进化型艰难梭菌菌株的葡萄糖EC50值高于祖先菌株，但进化型菌株在高葡萄糖浓度下表现出更高的生物量(即更高的最大生长产量，图S10C和S10F)。这种生物量的增加并未通过单细胞水平上细胞大小和形态的变化来解释(图S7E)。这些发现暗示了在葡萄糖的生长产量和敏感性之间存在权衡。总之，进化型艰难梭菌菌株的代谢活动改变影响了其在不同脯氨酸和葡萄糖组合环境中的适应性(图3G、3H和S11)。在高葡萄糖和低脯氨酸浓度条件下，相比祖先菌株，进化型菌株的适应性得到了增强。在某些环境中，这种适应性改变可能使进化型菌株在定殖过程中优于其他菌株，从而可能影响疾病结果。
进化型艰难梭菌菌株显示出与人类肠道菌群的种间交互作用的变化
艰难梭菌代谢的显著变化将影响人体肠道微生物群种间的交互作用。为了探讨这些关键突变如何影响生态网络，我们构建了包含进化型或原始艰难梭菌菌株的2-8成员群落的96种组合。其他种类(CS、CH、DP、BT、PV、BU和CA)在长期培养实验中使用，广泛分布于不同个体之间，涵盖了人类肠道微生物群的系统发育多样性，并在不同环境中被广泛研究(图4A)。我们将gLV模型拟合到物种绝对丰度的时间序列数据(表S3 DATASET002；图S12A、S13A和S13B)。为了评估模型对未使用数据的预测性能，我们进行了20倍交叉验证(图S12B；STAR Methods)。模型预测与测得的物种丰度之间的吻合度良好(Pearson’s R = 0.95–0.99, p
图4 | 关键代谢基因突变改变了艰难梭菌与人体肠道微生物群种间的交互作用
(A) 工作流程示意图，用于解析艰难梭菌祖先株和进化株与人体肠道微生物之间的交互作用(STAR 方法；表 S3 DATASET002)。
(B 和 C) 7种肠道微生物与祖先(B)和进化(C)艰难梭菌株之间的推断种间交互网络。节点大小代表各物种的载体容量，边的宽度表示种间交互系数 (aij) 的大小。热图显示了社区中8种物种之间的 aij。
(D) 祖先株与进化株艰难梭菌株的社区之间 aij 的散点图。灰色(蓝色)数据点是两种肠道微生物之间(艰难梭菌与肠道微生物)的 aij。蓝色虚线表示两社区 aij 值之间的线性回归。两侧皮尔逊相关系数 r 和 p 值显示。
根据推断的gLV参数，两种交互网络都显示出频繁的负交互作用，符合之前的研究发现(图 4B 和 4C)。与祖先株(18%)相比，进化株(25%)存在更多的正交互作用。值得注意的是，15%的推断交互作用具有不一致的符号。祖先株和进化株艰难梭菌株之间的种间交互系数显示出中度的相关性(皮尔逊 R = 0.59，p = 1.8E−06；图 4D 和 S12D)。相比之下，作为参考，不同遗传背景的艰难梭菌株之间种间交互作用的差异不频繁(所有艰难梭菌株对之间的皮尔逊 R 值为 0.81–0.89，p = 3.4E−14 至 7.6E−20)。这一发现突显了艰难梭菌代谢基因中两个关键单点突变对人体肠道微生物种间交互作用的重大影响。例如，CS 和 CH对祖先株的抑制作用显著大于进化株。由于 CS 和 CH 在我们的培养基中显著消耗了脯氨酸(图 S6B)，因此与艰难梭菌代谢生态位的改变相比，祖先株可能与 CS 和 CH之间的资源竞争程度高于进化株。
艰难梭菌的演化适应间接影响了其他群体成员之间的配对交互作用(图 4B–4D)，这表明网络中可能存在更高阶交互作用(HOI)。为了直接捕捉潜在的 HOI，我们使用了一种修改的 gLV 模型，其中包含群体成员之间的配对和第三阶交互作用(gLV-HOI)进行数据拟合(图 S12E、S13C 和 S13D；STAR 方法)。通过 20 倍交叉验证，gLV-HOI 显示出高预测性能(皮尔逊 R = 0.93–0.98，p
演化适应的艰难梭菌菌株在哺乳动物肠道中减轻了疾病严重程度
氨基酸如脯氨酸已被证明能够调节艰难梭菌毒素的体外生成，并影响哺乳动物肠道的定植。为了确定艰难梭菌的关键演化适应是否会改变毒素的生成，我们通过酶联免疫吸附检测法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)在培养24小时后进行了毒素表达分析。演化适应的艰难梭菌菌株显示出显著较低的毒素浓度和产量(浓度与OD600之比)，相比于祖先菌株，在多种氨基酸浓度下均如此(Figures S15A和S15B)。
为了研究演化适应的艰难梭菌菌株是否影响疾病的严重程度，我们利用小鼠模型，将演化适应的或祖先的艰难梭菌菌株通过口服灌胃引入无菌小鼠体内，实验中部分小鼠没有人体肠道菌群（见图 5A）。具体而言，小鼠分别通过口服灌胃接种单一菌群（PV），另一部分小鼠则接种由七种人体肠道菌群组成的菌群（CS, CH, DP, BT, PV, BU, CA），这些菌群在我们的长期培养实验和菌群特性分析中均有应用（见图 1和4）。这些菌群在挑战前的8天被引入，旨在促进小鼠免疫系统的发育和菌群定植。在单独挑战艰难梭菌的小鼠组和带有七种菌群的小鼠组中，相较于祖先菌株，演化适应的艰难梭菌菌株表现出显著较低的丰度和毒素浓度。这种艰难梭菌的定殖减少可能导致毒素生成较少，因为毒素产量（毒素量除以艰难梭菌菌落形成单位 [colony-forming unit, CFU]）在两个组之间相似（见图 S15D）。这种与体外实验中的毒素产量不一致（见图 S15B）的现象表明，毒素在体内和体外的调控机制存在差异。为了更全面地探讨祖先或演化适应的艰难梭菌菌株的影响，我们聚合了所有处理组的数据，分析微生物群落组成的变化（见图 S15C）。在所有微生物群落条件下，挑战演化适应的艰难梭菌的小鼠显示出更高的存活率，并显著低于挑战祖先菌株的小鼠，相对体重减轻尽管所有小鼠在最初几天体重均显示出下降趋势（见图 5B–5D和 S15C）。
图5 | 演化适应的艰难梭菌菌株缓解了小鼠的疾病严重性
(A) 小鼠实验示意图。小鼠在引入原始或演化适应的艰难梭菌菌株前，分别被挑战于没有任何肠道菌群干预(仅艰难梭菌组)或通过PV菌株或7种肠道菌群组合(CS、CH、DP、BT、PV、BU和CA)进行口服灌胃8天。
(B–D) 小鼠在仅接受艰难梭菌(n = 4)(B)、PV与艰难梭菌(n = 4)(C)以及7种肠道菌群与艰难梭菌(n = 4)(D)口服灌胃后，存活百分比、初始体重百分比、艰难梭菌丰度以及艰难梭菌毒素浓度(每mg盲肠内容物)。在存活率上，log-rank检验显示了显著的p值。在初始体重百分比上，线条表示该组所有小鼠的平均值。体重下降至75%以下的小鼠会被淘汰。在艰难梭菌丰度方面，通过CFU计数法确定值，该方法使用了盲肠内容(存活)和盲肠内容(死亡)进行艰难梭菌选择性培养基的检测。在盲肠内容中的艰难梭菌毒素浓度方面，数据以平均值±标准差表示。由于在多个治疗组中，小鼠在第3天死亡，因此在第4天之后的数据点比总的实验小鼠数量少。因此，体重(%)和艰难梭菌丰度的统计检验仅在数据完整的第1到第3天进行。对于体重(%)、艰难梭菌丰度和艰难梭菌毒素浓度的图示，使用两侧的未配对t检验显示了显著的p值。部分图表由Biorender生成。
PV单菌群显著降低了祖先艰难梭菌菌株的毒素浓度，使其与演化菌株达到相似水平（见图 5B、5C 和 S15E）。同时，PV显著增加了演化菌株艰难梭菌菌株在某些时间点的定殖（见图 S15F），导致祖先菌株和演化菌株的艰难梭菌菌株在定殖方面达到相似水平（见图 5B 和 5C）。根据16S rRNA基因测序，PV在挑战演化菌株的小鼠中相对丰度较高，而与祖先菌株相比（∼77% 对 60%，7天后）（见图 S15G）。由于祖先菌株和演化菌株的绝对丰度在CFU计数法下相似（见图 5C），这一结果表明，PV在携带演化菌株的小鼠中的丰度高于携带祖先菌株的小鼠。因此，这些数据表明，PV和艰难梭菌菌株之间存在双向互动，影响小鼠肠道中的定殖能力和毒素生产。
在口服七种肠道菌群的小鼠中，存活率显著低于仅携带艰难梭菌和PV单菌群的小鼠组（见图 5D）。这表明，七种肠道菌群显著增加了艰难梭菌的疾病严重性。挑战后第三天，在携带七种肠道菌群的小鼠中的祖先艰难梭菌菌株丰度显著高于其他组（p值 = 0.02）（见图 5B–5D）。PV在携带祖先或演化菌株的小鼠中显示出最高的相对丰度（∼50%，接种几天后，见图 S15H）。由于PV单菌群定殖未显著改变疾病严重性，因此携带七种肠道菌群的小鼠相比其他组观察到的疾病严重性增加可能是由其他菌群的存在、PV与艰难梭菌的交互作用变化或宿主-微生物交互作用导致的。总之，在所有条件下，与祖先菌株相比，演化菌株艰难梭菌菌株在小鼠肠道中显示出显著降低的定殖能力和疾病的严重性（见图 5B–5D 和 S15C）。
作者简介
美国威斯康星大学麦迪逊分校Jordy Evan Sulaiman为本文第一作者，美国威斯康星大学麦迪逊分校教授Ophelia S. Venturelli为本文的通讯作者。
Ophelia S. Venturelli（通讯作者）
Ophelia S. Venturelli 是微生物组研究领域的杰出科学家，她通过结合实验和计算建模的方法，深入揭示了微生物群落的动态行为及其与环境和宿主的相互作用。她开发了高通量工具来系统解析微生物组的复杂交互网络，为微生物群落的工程设计和精准微生物组疗法提供了基础。她的研究成果发表在《Nature Communications》等期刊。Venturelli 的跨学科研究整合了系统生物学、合成生物学和机器学习等领域，为生物医学、农业和环境科学带来了深远影响，为精准操控微生物组的功能开辟了新方向。
翻译：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读
审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后
终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导
排版：杨海飞，青岛农业大学，基因组所联培硕士在读
宏基因组推荐
1月10-12日，单菌基因组组装、注释、遗传表征、分子分型、系统进化和传播溯源
2月21-23日，家系、肿瘤临床基因组/外显子组数据分析
3月21-23日，高级转录组分析和R语言数据可视化
3月28-30日，第二届全国基因组信息学大会
4月11-13日，微生物组-扩增子16S分析
5月11-13日，微生物组-宏基因组分析
本公众号现全面开放投稿，希望文章作者讲出自己的科研故事，分享论文的精华与亮点。
投稿请联系小编（-genomics）
iMeta高引文章 fastp 复杂热图 ggtree 绘图imageGP 网络iNAP
iMeta网页工具 代谢组MetOrigin 美吉云乳酸化预测DeepKla
iMeta综述 肠菌菌群 植物菌群 口腔菌群 蛋白质结构预测
10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature
为鼓励读者交流快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”讨论群，己有国内外6000+ 科研人员加入。请添加主编微信meta-genomics带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。高级职称请注明身份，另有海内外微生物PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。
来源：微生物组