摘要：体外下拉试验（In vitro pull-down assay）又称蛋白质下拉实验，主要用于研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸或其他生物分子之间的相互作用。在体外下拉试验中，通常将感兴趣的蛋白质（称为“诱饵”）固定在固相载体上，如琼脂糖珠或磁珠，然后将含有可能与

体外下拉试验（In vitro pull-down assay）又称蛋白质下拉实验，主要用于研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸或其他生物分子之间的相互作用。在体外下拉试验中，通常将感兴趣的蛋白质（称为“诱饵”）固定在固相载体上，如琼脂糖珠或磁珠，然后将含有可能与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白质（称为“靶”）的溶液加入反应体系中。通过洗涤和分离，未结合的蛋白质被去除，而结合的靶蛋白则被“拉下”并固定在固相载体上。后续通过电泳和质谱等分析手段，可以鉴定出与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。体外下拉试验通过模拟细胞内复杂的生物环境，帮助科学家揭示分子间的相互作用机制，从而为理解生命过程提供信息。体外下拉试验的应用非常广泛。其不仅可用于确认已知的蛋白质相互作用，还可以用于发现新的相互作用网络。此外，体外下拉试验还可以帮助研究蛋白质复合物的组成，从而揭示复杂生物功能的分子基础。例如，在信号传导研究中，体外下拉试验可用于鉴定参与特定信号通路的组成分子，从而为靶向治疗提供线索。

一、体外下拉试验分析步骤

1、准备：获取高纯度的目标蛋白，可通过原核或真核表达系统进行重组表达、纯化；选择合适的亲和标签（常见的有 GST、His 标签等）标记目标蛋白，准备对应的固相载体；制备细胞裂解液，其含有丰富的细胞内源性蛋白质，作为潜在相互作用蛋白的来源。

2、固定目标蛋白：将带有亲和标签的目标蛋白与固相载体孵育，使二者特异性结合，从而将目标蛋白固定在载体表面。例如，GST 融合蛋白与 GST 亲和树脂结合，形成固定化的 “诱饵”。

3、孵育与结合：把固定有目标蛋白的固相载体放入细胞裂解液中，在适宜的温度（常为 4℃）、时长（数小时至过夜）条件下缓慢摇动孵育，促进可能存在的相互作用蛋白与目标蛋白结合。

4、洗涤：孵育结束后，使用缓冲液多次洗涤固相载体，目的是洗去未与目标蛋白结合的杂蛋白，减少背景干扰，这一步骤对结果的特异性至关重要。

5、洗脱：运用合适的洗脱试剂（如含游离亲和标签的溶液、高盐缓冲液、改变 pH 的缓冲液等）将结合在目标蛋白上的相互作用蛋白从固相载体上洗脱下来。

6、检测：采用 Western blot、SDS - PAGE 电泳、质谱分析等手段对洗脱下来的蛋白进行鉴定和分析。

来源：老妖聊科学