Sci Adv丨蒋进教授课题组揭示Hedgehog信号通路转录因子Ci/Gli激活的新机制

摘要：Hedgehog信号通路是生物体内重要且非常保守的信号通路，它既在胚胎发育中起决定性的作用，同时又能调控成体细胞的增殖与分化。Hedgehog信号通路的异常会引起某些发育遗传疾病，而且也是某些癌症（BCC，Basal Cell Carcinoma和Medul

Hedgehog信号通路是生物体内重要且非常保守的信号通路，它既在胚胎发育中起决定性的作用，同时又能调控成体细胞的增殖与分化。Hedgehog信号通路的异常会引起某些发育遗传疾病，而且也是某些癌症（BCC，Basal Cell Carcinoma和Medulloblastoma）发病的成因之一。与其他信号通路相比，Hedgehog信号通路一个重要特性是其有着更严格的剂量依赖性（Dosage Dependency），即下游接收细胞会根据上游配体浓度而做出相应的响应。这种严格的剂量依赖性对生物体在胚胎发育中的体节发生和极性的形成有着至关重要的作用。

Hedgehog信号通路的激活主要通过上游细胞分泌配体Hh与下游接收细胞的膜上受体Patched结合，从而解除Patched对GPCR样蛋白Smoothened的抑制。随着Smoothened蛋白的磷酸化，寡聚化和构象的改变，会造成Smoothened在细胞膜上的累积以及下游丝氨酸/苏氨酸激酶Fused （果蝇）的激活。而有活性的Fused能够拮抗Sufu （Ci/Gli的结合蛋白）对hedgehog信号通路转录因子Ci/Gli的抑制作用，将原来有转录抑制作用的CiR转变为有转录活性的CiA。在哺乳动物细胞中，Hedgehog信号通路的激活主要发生在初级纤毛（Primary Cilium）这个特殊的细胞器中，而且Smoothened激活的下游激酶主要是Fused的家族同源蛋白Ulk3，Ulk4和Stk36。

近日，美国德州大学西南医学中心分子生物学系蒋进教授等在Science Advances发表研究文章：Morphogen-induced kinase condensates transduce Hh signal by allosterically activating Gli。该研究发现Fused/Ulk3激酶通过自体磷酸化和类泛素化（SUMOylation）修饰来促进自身的多聚化和凝结（condensation）。而在凝结物中，Fused/Ulk3通过构象变化（被称为构象成熟化conformation maturation）来异构调节（allosteric regulation） Gli与Sufu的结合，从而激活转录因子Gli。

蛋白激酶Fused在Ci的激活中起着关键作用；但一直以来有关Fused的两个关键问题一直未能得到解决：1）Fused最重要的底物未知，由于Fused的底物一致序列（consensus sequence）未知，从而对发现它的底物造成了极大的困扰。已有的研究发现Fused可以磷酸化Sufu和Cos2，但相应的体内实验结果又对这些磷酸化修饰的生物学意义提出了质疑。同时蒋进实验室发现Fused和它在哺乳动物内的同源蛋白Ulk3可以分别磷酸化Ci和Gli。2）Fused激活转录因子Ci的生物化学机制。现有的模型认为Fused通过磷酸化Ci或某个Ci的结合蛋白（Sufu或Cos2）来激活Ci。但细胞实验发现即使过表达的高度活性的Fused也只能激活细胞中一部分的Ci，而且Fused在细胞中的表达量远高于Ci，这些发现不符合现在的模型和Hedgehog通路严格的剂量依赖性，提示Fused与下游的Ci可能不是单纯的酶与底物的关系。

为了解决以上问题，该研究首先发现Fused在Hh刺激下会磷酸化其自身C末端的S271，S482位点，突变S271，S482以及相应的下游CK1激酶位点（T274，S485/T486）在体内和体外实验中都能使得Fused无法激活Ci，但并不影响它的激酶活性。进一步研究发现Fused的这两个自体磷酸化位点都处于逆向依赖于磷酸化的类泛素化序列中（IPS，Inverted Phosphorylation dependent SUMOylation），体外实验和细胞学实验都证明Hh刺激下的Fused的自体以及下游的CK1位点的磷酸化（S271/T274, S482/S485/T486）能够促进Fused的类泛素化（K279，K490），在细胞学实验和果蝇体内实验都显示，突变这两个类泛素化位点或是压制类泛素化酶E2 （Ubc9）表达都会使Fused失去激活Ci的能力，但同样不会影响它的激酶活性。除了上述类泛素化位点，作者发现Fused还存在类泛素结合序列（SIM，SUMO Interacting Motif），通过SUMO和SIM的相互作用，纯化的体外磷酸化和类泛素化的Fused能够在体外多聚化和凝结；而细胞内的Fused在Hh的刺激下也能形成凝聚体（condensate）。而且这种凝聚体能够抵抗各种化学试剂的处理，包括1，6-己二醇和SDS （4度低温下），同时FRAP （Fluorescence Recovery After Photobleaching）实验也证明Fused激酶这种通过SUMO和SIM相互作用形成的凝聚体不同于常见的LLPS （Liquid-Liquid Phase Separation），结构极其稳定。

更有趣的是除了以上自体磷酸化促进的类泛素化进而形成凝聚物之外，该研究还发现Fused激酶还能在Hh刺激下通过构象变化形成一种能够抗拒SDS的结合异常紧密的二聚体（SDS-Resistant）。而这种二聚体的形成是依赖于Fused的自体磷酸化，类泛素化和凝聚化的，即突变Fused的自体磷酸化，类泛素化以及类泛素化结合序列都会使Fused无法形成以上的二聚体。同时实验证据表明这种二聚体的形成在时间上，剂量上完全平行于Ci的激活（以Ci的磷酸化为表征）。最后，体外的生化实验证明Hh刺激下被激活的Ci分子（CiA）是一个至少包含Ci，Sufu和Fused激酶的蛋白质复合物。在这个复合物中Fused主要以SDS-Resistant的二聚体形式存在，而Sufu蛋白从平时的闭合（Closed）构象转变为开放（Open）构象，使得它与Ci的结合变弱，使得Ci能够被激活的Fused磷酸化，而这种磷酸化反过来又能稳定整个蛋白质复合物的构象。所有这些结果都证明了Fused激酶这种独特的二聚体的形成是Fused激酶激活Ci的关键步骤。

该研究进一步通过体内细胞实验，体外重组实验来探索Fused二聚体产生以及与其如何改变Ci-Sufu结合构象的分子机理，结果发现1）该二聚体的产生是在Fused依赖SUMO-SIM结合的凝聚体内，缓慢产生并以蛋白质复合物的形式离开凝聚体。2）该二聚体的产生需要新的类泛素化（SUMOylation）以及依赖于某些未知的辅助蛋白。3）该二聚体的产生与Ci-Sufu结合构象的改变是偶联的。

与上述在果蝇中的研究结果相似的是，在哺乳动物细胞中Fused激酶同源蛋白Ulk3也包含两个逆向依赖于磷酸化的类泛素化序列以及至少一个被发现的类泛素结合序列，它们互相之间的作用也能介导Ulk3形成凝聚体，而凝聚体中也能形成抗拒SDS的多聚体，从而改变Gli与Sufu的结合构象，从而使的Gli能被磷酸化。两者主要的区别在于Ulk3所形成的凝聚体主要在初级纤毛的尖端（tip）形成。

综上所述，蒋进教授课题组的此次研究揭示了Fused/Ulk家族激酶通过自体磷酸化 (autophosphorylation) 来促进类泛素化 (SUMOylation) ，然后通过SUMO-SIM之间的结合作用形成凝聚体；而在凝聚体中该激酶家族蛋白构象变化来别构调节（allosteric regulation） Ci/Gli与Sufu之间的作用，从而激活Ci/Gli的转录活性，并以蛋白质复合物的形式（至少包含Ci/Gli, Sufu和Fused/Ulk3）离开凝聚体, 进入细胞核激活下游基因的转录。

该研究除了解决Hedgehog信号通路中Fused/Ulk家族激酶如何激活Ci/Gli转录因子的机理问题，同时还有其他重要的生物学意义。首先，该研究提出了蛋白激酶激活转录因子的一种全新的模式；其次，该研究提出了凝聚体生物学功能的一个全新的方向，已知凝聚体主要是起到了富集蛋白，增加局部分子浓度的作用，而该研究提出了蛋白分子可以在凝聚体中通过别构调节来改变分子构象，调节活性；最后，该研究也为继续研究Fused/Ulk激酶家族的功能起到了指引的作用，蒋进教授课题组的最新研究发现本家族中Ulk4蛋白是一个假激酶（Pseudo Kinase），虽然其失去了激酶活性但其C末端仍然保留了逆向依赖于磷酸化的类泛素化序列中（IPS，Inverted Phosphorylation dependent SUMOylation）和类泛素结合序列（SIM，SUMO Interacting Motif），而本家族的另一个成员Stk36保留了激酶活性而失去了C末端的IPS和SIM序列，然而这两个蛋白在功能上可以互补，即Stk36可以磷酸化Ulk4，促进其类泛素化和凝集化，通过类似的机制来激活Gli (BioRxiv, doi: 10.1101/2024.09.19.613872) 。